拟南芥原生质体制备及转染

原生质体制备

1. 材料

（1）正常生长的拟南芥叶片（7-10片），3-5周的植株。

（2）两种胶带，原胶带固定上表皮，透明胶带固定下表皮。

（3）酶解液试剂：10mL，pH5.7

1% cellulose 0.1g

0.25% macerozyme 0.025g

0.4M甘露醇 0.782g

10mM氯化钙 0.011g

20mM氯化钾 0.0149g

0.1%BSA 0.01g

20mM MES 0.0426g

1. 撕掉表皮后将叶片泡入有酶液的培养皿（慢慢摇，40rpm），20-60分钟。
2. 将protoplast 100g 离心3min，用25mL W5重悬洗涤2遍，冰浴30min。

（试剂100mL W5（pH5.7）：154mM氯化钠-0.9g，125mM氯化钙-1.39g，5mM氯化钾-0.037g，5mM葡萄糖-0.09g，2mM MES-0.00426g）

1. 冰浴时，用红细胞计数器计算原生质体的数量。
2. 冰浴结束，离心（100gХ3min），MMG溶液重悬（使数量为2-5x105/m2细胞），体积看时冰浴结束。
   （100mL MMG（pH5.7）: 0.4M甘露醇 7.28g，15mM氯化镁 0.3045g，4mM MES 0.0852g）

原生质体转化

1. 0.2mL MMG溶液（原生质体），混合30μg质粒（室温），加入等体积的现配的PEG溶液（40%（W/V），0.1M氯化钙，0.2M甘露醇），室温放置5min。
2. 缓慢加入3mL W5，轻轻混匀，100g*1min。
3. 去上清，重新用W5洗2遍，最后用1mL W5重悬
4. 将其转入6孔板中（6孔板已用1%BSA覆盖，防止贴壁），室温放置16小时。

试剂PEG4000 溶液：50mL（pH5.7），PEG400：40%（W/V）：20g，0.1M氯化钙：0.555g，0.2M甘露醇：1.82g

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