名词解释：
PMI:postmortem interval 死亡间隔，简单的说就是死亡后多长时间做了snRNA-seq
granule neurons和neuroblasts的关系：
Neuralcircuitsinthe hippocampus . Adult neural stem cells in the hippocampus (radial glia-like cells, type 1 cells) and their differentiation in the SGZ of the DG (lower panel) with cell type-specific transcription factors
(2005，Review: adult neurogenesis contributes to hippocampal plasticity)
3：
DCX RNA is not a specific marker of neuroblasts or immature granule neurons:
DCX RNA不是成神经细胞和未成熟颗粒细胞的特异性marker genes
为了进一步研究神经发生潜能，我们分析了不同物种DCX RNA的表达。来自四个物种的数据集被 down-sampled到相同的测序深度，以获得可比指标（STAR方法）。这揭示了DCX表达水平的可比程度和物种间的相似表达模式，但在小鼠成神经细胞中选择性富集，在猪和猕猴成神经细胞中选择性富集（图3A）。重要的是，在不同物种的颗粒细胞中发现DCX表达至少具有一个唯一分子标识符（UMI），其中人类表达最少（小鼠，3.21%；猪，14.88%；恒河猴，3.08%；人类，110/32067或0.34%）（图3A；表S3）。然而，一个UMI是低基线，可以表示背景，并且不能可靠地赋予cell identity（图S1D）。
因此，我们比较了至少2个UMI的DCX表达，发现了类似的模式，但人类的表达最为稀少（小鼠，0.51%；猪，1.97%；恒河猴，0.2%；人类，32067中的4个或0.01%；表S3）。相反，在非颗粒细胞中检测到显著的DCX表达，尤其是在INN中，其中7.28%表达至少2个DCX UMI（图3A；表S3），这表明低表达而非低检测是DCX在人类颗粒细胞中罕见存在的解释。尽管人类样本总体上具有较长的PMI（表S1），但DCX的这种明确表达表明，较长的PMI并不限制DCX转录本的检测。
尽管如此，我们通过在猪脑中进行snRNA-seq分析进一步评估了PMI的效果，PMI为30分钟、1小时和7小时。猪脑保持在室温下（温暖的PMI），而我们研究中使用的人体标本在冷藏（冷PMI）之前，通常在室温（暖PMI）下停留不到4小时，以减缓组织和细胞的退化，直至尸检。与低温保存的猪脑相比，猪脑中较长的温暖PMI可能会加剧死亡时间间隔的影响，但结果显示，在所有三种情况下，DCX的表达相似，神经祖细胞和神经母细胞的数量相似，再次表明，PMI可能不是影响RNA保存和/或检测的重要因素（图S3C）。与人类相似，在所有分析的物种中都检测到神经母细胞/颗粒细胞群之外的DCX表达，但在猪和灵长类动物中比在小鼠中更为显著（图3B）。这些结果表明DCX表达本身不足以定义成人神经发生。
为了进一步研究表达110 DCX的人类颗粒细胞是否可能是成神经细胞，我们测试了与DCX阴性颗粒细胞相比，它们是否富含成神经细胞标记物。我们的结果显示，神经母细胞标记物缺乏富集（图3C），这种模式在原始人类数据中持续存在，在向下采样之前具有更高的深度（图S3B）。这一结果与小鼠、猪和猕猴形成了鲜明对比，它们在表达DCX的颗粒细胞中显示出神经母细胞标记物的保守富集，证实了该方法检测潜在神经母细胞的稳健性超越了物种差异。这一结果进一步证实了综合分析所揭示的人类DG样本中缺乏可检测的神经发生轨迹，并表明成熟颗粒细胞在成人DG中表达某种程度的DCX，类似于其他成熟神经元群体。
我们在年轻成年小鼠和猪、成年恒河猴和人的海马上使用两种不同的常用抗DCX抗体，通过免疫组织化学补充这些snRNA-seq分析。如前所述（Guidi等人，2011年；Jabe's等人，2010年；Seki，2002年），小鼠、猪和小鼠在DG中表现出大量具有未成熟和成熟颗粒细胞形态的DCX免疫标记（DCX-IL）细胞（图3D）。在人类中，我们测试了一组10例患者（表S3），其中髋部和EC或杏仁核可用。我们将杏仁核作为DCX检测的内部对照进行筛选，因为杏仁核在层旁核中含有大量强烈免疫反应的细胞（Sorrells et al.，2019）。为了最大限度地进行检测，我们使用了几种抗原提取方案，包括先前研究中使用的一种（Moreno Jiménez等人，2019年；Flor Garćıa等人，2020年）。
然而，我们没有看到两种方案之间的显著差异。通过标准用标准柠檬酸缓冲液抗原提取，我们可以在所有病例的杏仁核中检测到大量可靠的免疫标记细胞，在EC和Rhi周围皮质中偶尔检测到少量DCX-IL细胞，在某些病例的亚区和CA区中检测到罕见的DCX-IL细胞（表S3）。虽然杏仁核和EC中的DCX-IL细胞在躯体和突起中显示出强烈的标记，但在DG中我们只发现一些轻微的DCX-IL细胞，主要位于分子层或亚颗粒区（SGZ）和门部，偶尔位于颗粒细胞层内（图3D、S3D-S3G和S3M-S3Q）。
然而，它们的形态和定位与GABA能INN比与未成熟颗粒细胞更为一致，事实上，其中一些被轻微标记为GAD1，这是INN的标记物（图3E和S3M–S3R）。这些结果与我们的snRNA序列分析一致。在其他区域，甚至在锥体细胞中也发现了类似的轻度标记细胞，这也表明了背景染色的可能性（图S3D–S3G），尽管在缺乏一级抗体的对照组中未检测到此类标记。
针对PSA-NCAM（啮齿动物DG中神经母细胞和未成熟神经元的选择性标记物）的免疫染色（Seki，2002）在人类中显示出完全不同的染色模式，在DG和肺门区域用InN形态标记许多细胞（图S3H），如前所示（Mikkonen等人，1998；Seki等人，2019），这与DCX转录本的典型神经源性谱系外的主要分布相匹配。我们没有将这些标记物共定位，因为抗DCX抗体需要抗原回收，并且抗PSA NCAM免疫染色不能耐受相同的治疗。
PMI对人体样本的可能影响并不排除DCX检测，因为我们可以在大部分为冷缺血PMI长达24小时的病例中检测到杏仁核和EC/嗅周皮质中的DCX-IL细胞。此外，我们使用免疫组织化学方法评估了猪DG在冷缺血PMI 15和24小时以及猕猴在冷缺血PMI 16小时时的PMI效果（图S3I-S3L；表S3）。在这两种情况下，DCX-IL细胞的数量都有所减少，其中一些表现为静脉曲张树突（图3D和S3I-S3L）。然而，这些结果表明，长时间的PMI并不排除在DG或相邻皮质中检测DCX-IL细胞。累积而言，我们的综合跨物种snRNA-seq分析和DCX免疫组织化学显示，在我们的小鼠、猪和猕猴（而非人类组织样本）中，成人神经发生的证据清晰有力。
4：
Taxonomic relationship of neural cells across the allo-, meso-, and neocortex
跨异皮质、中皮质和新皮质神经细胞的分类关系
海马-内嗅系统中神经元与新皮质神经元之间的假定同源性，特别是同种异皮质、中皮质和新皮质之间的细胞结构和进化转变，为揭示大脑皮层特化和功能的组织原理提供了机会 . 为了阐明这些原则，我们比较了海马-内嗅亚区的细胞概况和两个人类新皮层区域内转录组学定义的细胞类型：背外侧前额叶皮层 (dlPFC/DFC) (Li et al., 2018) 和颞中回 (MTG)。
除了我们在 HIP 的每个子域中观察到的显着异质性（图 1E），我们还观察到 CA 域和 Sub 的 ExN 与 EC（图 4A 和 4B）以及 新皮质 MTG 和 dlPFC。 正如层流结构(laminar structure)所预期的那样，我们观察到 MTG 和 dlPFC 的 ExN 之间具有更高的相似性，并且在较小程度上，EC 的 ExN 与 MTG 和 dlPFC 的 ExN 之间（图 4B）。 我们总共揭示了 15 个具有区域特异性的 ExN 亚型（DG 中的三个，CA2-CA4 中的两个，CA1 中的两个，Sub 中的两个，EC 中的五个，dlPFC 中的一个，如图 4B 所示)。
特别是，我们发现新皮质中的深层 ExN 亚型在 EC 中得到了很好的体现，并且在较小程度上在 HIP 中得到了很好的体现，但上层神经元亚型并未得到很好的体现（图 5A 和 S4A）。例如，我们确定了两种 EC 亚型，它们具有表达 RELN 的第 2 层细胞的特征，类似于之前的报告（Witter 等人，2017），与在新皮质中检测到的任何 ExN 亚型都没有密切对应（图 4B）。与这一观察结果一致，HIP ExNs 的所有亚型都显示出新皮质深层 ExNs 的分子标记表达高于上层 ExNs（图 S4A 和 S4B）。此外，我们观察到与其他新皮质 ExN 群体相比，每个 HIP ExN 亚型中脑内投射神经元的关键分子标记的表达较低（图 S4C），这可能反映了人类海马亚区向边缘区域的受限且主要是同侧的端脑投射（Cenquizca 和 Swanson，2007 年）。
然而，有一种 DG 颗粒细胞亚型在转录组学上类似于 EC 中的一种上层 ExN 亚型（图 5A），这可能概括了在小鼠 HIP 和新皮质之间发现的相似性（Yao 等，2021）。我们接下来确定了几个基因，这些基因是 HIP 内 ExNs 分子特异性的基础，包括 CHRNA1、METTL7B 和 P2RX2。为了深入了解它们在海马体发育和成熟中的潜在作用，我们随后检查了它们的时间表达并发现了上调和下调的混合模式（图 5C）。这表明海马特化的分子协调发生在使用多个过程的多个时间点。
与观察到的 ExNs 模式相反，InNs 在异皮质、中皮质和新皮质之间没有表现出明显的转变，只有两个 HIP InN 簇（InN MEIS2 SHISAL2B 和 InN SST ADAMTS12）在 EC 中缺乏明确的对应物， MTG 和 dlPFC（图 4C、4D 和 5D）。前者与白质 InN 亚型相匹配（Frazer 等人，2017 年；Tasic 等人，2018 年），细胞群的变化实际上可以反映组织解剖的差异。另一种细胞类型，InN SST ADAMTS12，以两个 EvC 纤毛复合体基因 EVC 和 EVC2 的表达为标志（图 5E），涉及海马纤毛刺猬信号（Breunig 等人，2008 年；Rhee 等人，2016 年； Park 等人，2019 年）。
最后，NNC 类型构成了异皮质、中皮质和新皮质分类中转录组学上最保守的种群，所有区域的每个亚型都具有高度相似性（图 4E 和 4F）。值得注意的是，假定的层间星形胶质细胞（Astro AQP4 GFAP，第 1 层）和原生质星形胶质细胞（Astro AQP4 CHRDL1，第 2-6 层）（Oberheim 等人，2009 年；Hodge 等人，2019 年）存在于所有四个区域（图 S4D)，这表明星形胶质细胞的分层可能不是哺乳动物六层新皮质的结果，而是一种古老的特征。这些发现表明，ExNs 在异皮质、中皮质和新皮质中表现出最显着的差异，包括与同种皮质相比，新皮质中脑内投射神经元的患病率增加。