如何对细菌基因组做SNP calling

本方法主要参考https://www.jianshu.com/p/e305f6824707

bwa-mem2 mem -t 4 -M PAO1.fasta fqdata/WT-LCG7144_combined_R1.fastq.gz  fqdata/WT-LCG7144_combined_R2.fastq.gz -o align_bam/WT.sam
samtools view -S -b align_bam//WT.sam -o align_bam/WT.bam 
samtools sort align_bam/WT.bam -o align_bam/WT_sorted.bam
java -jar build/libs/picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES=true I=/edisk1/genomic-data/200804-Nova/snp_calling/align_bam/WT_sorted.bam O=/edisk1/genomic-data/200804-Nova/snp_calling/rmdup_out/WT_sorted_rmdup.bam M=/edisk1/genomic-data/200804-Nova/snp_calling/rmdup_out/WT_marked_dup_metrics.txt
samtools faidx PAO1.fasta
samtools mpileup -f PAO1.fasta rmdup_out/WT_sorted_rmdup.bam -o WT_raw_var.bcf
java -jar /edisk1/program/VarScan.v2.4.4.jar mpileup2cns casein-mut7_var.bcf  --min-var-freq 0.5 --p-value 0.05 --variants --output-vcf 1 >mut7_variants_0.5.vcf
java -Xmx4g -jar snpEff.jar -v Pseudomonas_aeruginosa_pao1 /edisk1/genomic-data/200804-Nova/snp_calling/mut7_variants_0.5.vcf > /edisk1/genomic-data/200804-Nova/snp_calling/mut7_variants_0.5_ann.vcf

注：在做snpeff之前，需要把vcf中chromosome的名字修改为Chromosome（注意第一个字母大写），否则会报错。

除了使用samtools call SNP，还可以用freebayes来call SNP，然后再用bcftools或者vcffilter进行过滤，得到高质量的SNP。但是如果要寻找基因组中的大片段丢失和插入，需要用pindel来call。

使用freebayes以及SNP过滤的例子如下：

freebayes -p 1 -C 5 -f PAO1.fasta WT.sorted.bam >WT.vcf # -p表示单倍体， -C 表示支持该SNP的最小reads数，-f表示fasta文件

vcffilter -f "QUAL / AO > 10" WT.vcf > WT.filter.vcf #用vcffilter进行过滤

bcftools filter -i 'AD[1]/(AD[0]+AD[1])>0.8' WT.vcf -o WT.filter.vcf #或者也可以用bcftools进行过滤，warning可以不管，AD[0]表示支持reference的reads数，AD[1]表示支持SNP的reads数

获得了vcf文件后，可以用vcfintersect比较两个vcf文件的差异

 vcfintersect -r PAO1.fasta -v -i WT.filter.vcf casein_mut21.filter.vcf # 前面的vcf文件为参考，后面的vcf是需要寻找差异的vcf

使用pindel的流程：

nohup pindel -f PAO1.fasta -i pila3_config.txt -o pila3_pindel -M 2 -T 8&  # -M 表示最小支持数 -T表示线程数
pindel2vcf -p pila3_pindel_D -r PAO1.fasta -R PAO1 -d 2020
pindel2vcf -p pila3_pindel_SI -r PAO1.fasta -R PAO1 -d 2020 #转换为vcf文件
bcftools filter -i 'AD[1]/(AD[0]+AD[1])>0.8' pila3_pindel_D.vcf -o ./pindel/pila3_D.vcf   #vcf文件过滤

另外可以参考：
https://www.jianshu.com/p/f8dcaa4fcc0d #比较vcf文件的方法
https://www.jianshu.com/p/1815de1090d3 #如何使用pindel检测复杂的indel
https://indexofire.github.io/pathongs/book/C18_Analysis-Examples/01_trace-Pae-from-different-source-by-SNP/ #寻找细菌SNP的一个例子
https://cloud.tencent.com/developer/article/1168253 #三种软件的使用教程