今天给大家分享的是2020年6月发表在《Nature Methods》上的文章，CRISPR-assisted detection of RNA–protein interactions in living cells，本文成功开发出了一种CRISPR介导的活细胞内RNA和蛋白互作检测的新方法。
通讯作者是西北大学医学院的严健老师，官网信息显示，严健老师主要研究方向包括：1，解析长非编码RNA的功能；2，系统分析遗传疾病的分子机理。严老师是国际顶级学术期刊的常客，并于2021年1月份在《Nature》上以第一作者和通讯作者的身份发表了“系统解析非编码DNA突变对转录因子结合的影响”的文章。
回到本文，作者将新开发的方法命名为CARPID，及CRISPR-assisted RNA–protein interaction detection的各单词开头字母组合。本文围绕lncRNA和RBP互作检测展开。该方法设计总体流程图如下：
发挥作用的成分主要是两部分，一部分是在gRNA引导下起靶向目的lncRNA的CRISPR/dCasRx（失活的CasRx，无切割编辑能力，只起到靶向作用），另一部分是BASU（生物素转移酶），可以将生物素（Biotin，图中的B）与结合了靶向RNA的蛋白质（RBP）进行结合。当RBP被生物素标记后，使用链霉素亲和偶联磁珠分离，然后对分离的蛋白质进行质谱的无标记定量对比分析，确认目的lncRNA的结合蛋白是哪些。
文章首先选取的lncRNA是XIST，其为X染色体失活特异转录因子，是比较经典的lncRNA。作者团队将lncRNA分为三段，分别用不同的gRNA去靶向这三段位点。
通过开发的新方法，作者团队检测到了400多种与XIST互作的RBP，韦恩图显示有447个蛋白在3个位点都被检测到（下图左a）；同时，作者在3个位点都进行了3次重复的实验，韦恩图显示3次重复检测到的RBP并不是随机出现的，而是较为稳定的，以此证明了该新方法检测的稳定性（下图右b）。
然后，作者通过富集分析，发现有73个蛋白被至少1个位点标记到，有23个蛋白被2个位点标记到，有13个蛋白同时被3个位点标记到（下图）。
作者通过分析比对，发现了2个与lncRNA XIST互作的新的未见报道的RBP（TAF15和SNF2L）。
下面的实验主要围绕TAF15和SNF2L开展，作者运用了多种检测RNA和蛋白互作的方法，如RNA-pull down; RIP; immunoFISH; CLIP-seq等技术对新发现的TAF15和SNF2L进行了验证（见下图）。证实了新方法发现的TAF15和SNF2L确实跟XIST存在着某种互作关系。
再之后，作者又对TAF15和SNF2L在X染色体失活中扮演的角色进行了探索，利用甲基化的X染色体失活，且不表达GFP，以及去甲基化后的X染色体活化，表达GFP这样的思路去设计实验，结合shRNA敲低TAF15和SNF2L的表达，以及回补实验，提出X染色体失活的新论点。
基本的逻辑如下：
TAF15敲低，GFP表达下降，X染色体失活；TAF15回补，GFP表达上升，X染色体活化。
SNF2L敲低，GFP表达上升，X染色体活化；SNF2L回补，GFP表达下降，X染色体失活。
表明了，X染色体失活可能存在两种途径，一种是如SNF2L引起染色质重塑，一种是如TAF15，驱逐转录激活因子。两种途径共同作用，导致了X染色体的失活。（见下图）
以上，文章逻辑形成一个闭环：利用自己开发的新型检测方法CARPID，发现了与lncRNA XIST有关的2个新的RBP，并利用多种RNA和蛋白互作检测方法，对新发现的RBP进行了验证，证实了TAF15、SNF2L和XIST之间确实存在互作关系，最后对TAF15、SNF2L在X染色体失活中扮演的角色进行了探索，并最终提出了导致X染色体失活的新机制。
文章的最后，作者又选择了另外两类lncRNAs（DANCR和MALAT1）进行了测试，表明CARPID对于不同长度和表达水平的lncRNAs具有较高的特异性和适用性。这里就不再赘述，感兴趣的可以下载原文进行学习。
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