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编者按
现在的软件更新实在太快了，光是转录组用来比对的软件就有很多，bowtie，
tophat，star，现在又有hisat以及hisat2，这款软件居然不叫tophat3。又得重新学习，好在万变不离其宗，短序列比对如何变化，都离不开基本的规律，因此，学习原理还是很重要的。
一、功能分类：
转录组短序列比对
二、软件官网：
http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml
三、软件介绍:
hisat是Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts，分层次索引的用于转录本是spliced比对工具。
hisat2也是一款短序列比对的工具，主要用于RNAseq数据的比对。Hisat2是hisat比对工具的升级版。而hisat是tophat2的替代工具。tophat是一款非常有名的工具了。在很长一段时期内，RNAseq分析都是按照《Nature Protocol》上那边经典的tophat+cufflinks的分析流程来。后来这套方法逐渐被各种R分析的包取代，现在更多采用DEseq，edgeR等R扩展包来分析RNAseq的数据，将reads比对参考基因组上，然后对每个基因比对的reads进行记数。然后得到一个矩阵，接下来利用R包进行数据分析。因为经过多年分析芯片数据，R语言已经累计了大量分析表达数据的内容，在分析RNAseq数据也是可以轻松转换的。
不过作者在2016年的时候，突然又发了一篇Protocol，推出一套hisat+StringTie + Ballgown的组合方法。其中hisat用于短序列比对，替代原有的tophat，StringTie用于拼接和定量，替代原有的cufflinks，balldown是一个R包，用于最后的差异表达计算以及可视化。完美替换之前的流程。目前这套方法称为RNAseq数据分析新的一套方案。
具体文章见链接 https://www.nature.com/articles/nprot.2016.095
HISAT2使用改进的BWT算法，所以速度更快，资源占用更少。直接下载编译好的版本直接解压缩就行了。
四、下载安装：
wgetftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/downloads/hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip
unzip hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip
五、软件使用：
和其他短序列比对工具一样，首先建立索然，然后比对。如果熟悉bowtie和tophat，那么上手hisat就非常容易了。
建立索引可以使用hisat2-build，如果从网站上下载就可以直接进行比对。
这里面注意一个特殊的地方是hisat2建立索引使，支持加入一些额外的信息，例如--snp，--haplotype，--exon等。加入这些信息之后，在比对的时候就会将这些信息考虑进去提高比对的效率。例如加上SNP信息，在比对到SNP位点就会将SNP信息考虑进去，本来如果是6个错配，这条reads没有满足最少5个错配的设置，应该算比对不上，但是如果软件识别其中2个错配属于SNP位点，那么就应该算作比对上了。
hisat2安装目录中有很多extract开头的python小程序可以将原始文件转换为hisat2-build能使用的文件。
hisat2-build–p4genome.fagenome
-sra-acc，这个选项接SRA的 accession ID，一次可以输入多个，用逗号分隔，HISAT会自动从NCBI的SRA数据库下载并转换这些数据进行比对。
-x hisat2的索引前缀，hisat2-build 建立的索引；
-1 reads1文件
-2 reads2文件
-S 输出结果文件，sam格式
这些是必须选项。很多时候直接使用这四个选项就可以运行软件。如果不是pairend reads，使用-U选项。
input选项，控制输入文件，比如指定输入文件类型，-q，-qseq，-f等，--phred33，--phred64指定质量值体系，这些选项都不较容易。
Alignment，设置一些比对默认，默认都是关闭的，用处不大
Spliced Alignment，这个里面包含了很多内容，用来控制RNAseq比对时split reads比对的细节。
Scoring控制比对罚分，也就是对于错配以及gap如何打分，不同短序列比对软件差异主要在这里，所以，对于不是完美匹配的reads，有的软件认为是有效比对，有的则当成没有比对上。
Reporting，只有一个选项-k，处理多重比对，最多输出的数目，默认是5。也就是一条reads最多只能匹配到五个位置。
Paired-end，设置insertsize范围以及pairend reads方向，matepair文库或者链特异性文库需要重新设置。
Output，输出选项，可以控制输入结果内容以及各式。其中--rg-id，--rg设置sam文件中RG标签内容，如果后续使用在GATK软件，需要这些内容
Performance，性能选项，-p设置多线程可以显著提高比对速度。
Other，没法分类的都放到这里，这里面这些都没什么大的作用，
六、使用案例：
hisat2-build–p4genome.fagenome
hisat2-xgenome-read.1.fq.gz-2read.2.fq.gz-Sall.sam
七、注意事项：
1、hisat2需要重新建立索引，与bowtie2和tophat2的索引不同；