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编者按：
克罗恩病（Crohn's disease,CD）是一种慢性肠道炎症性疾病，被认为是肠道固有免疫和获得性免疫失调节的结果。CD可引起一系列胃肠道症状，包括腹痛、腹泻、肠梗阻、体重减轻等，有大约70%的患者在整个病程中需要接受手术治疗。在CD和结直肠癌（colorectal cancer ,CRC）的研究中有一条重要通路Hippo信号通路，该通路进化较保守，在细胞增殖，凋亡和分化过程中发挥重要的作用。正常情况下，Hippo信号通路是被严格调节的，YAP/TAZ也受到上游抑制性激酶MST1/1以及LATS1/2的调控，这些激酶在再生反应中释放出来。
在此前的研究中，MiR-590-5p被报道报道通过抑制CRC中的YAP来抑制肿瘤发生，同时具有肿瘤抑制作用和肿瘤发生作用，除此之外，MiR-590-5p也可以抑制炎症中的信号通路。
本期给大家带来由上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科-结直肠专业组于2018年6月发表在Journal of Crohn's and Colitis（IF=7.827）的研究论文。文章从发现CD中YAP上游的MiR-590-5p低表达起，探讨了MiR-590-5p调节YAP蛋白表达在CD、结肠炎和CRC患者中的作用，阐释了该调节作用对于炎症发生、促进和肿瘤生成的影响。
本研究中，YAP作为Hippo信号通路的一份子，在CD和小鼠结肠炎模型中均被检测到上调。然后作者研究了YAP相关miRNA在调节CD病理发生中的作用。而经过筛选MiR-590-5p在CD中显著下调，实验又揭示了MiR-590-5p对于YAP的调控作用，并且在小鼠结肠炎模型中也遵循这一调节规律，并且进一步验证了MiR-590-5p/YAP轴在人CRC中的作用。同时本研究对于Hippo信号通路在肠再生和癌症发生作用具有更为扩展的理解。
结果解读：
Hippo信号通路对于CD发病的具体作用仍是未知的，因此在研究的初始阶段，研究者从CD患者及健康者的活检标本中分离得到了原代肠上皮细胞IECs，之后，经过qRT-PCR检测，确定出了在所选取的Hippo信号通路中mRNA显著表达升高的分子YAP（B图）。通过对CD患者炎症肠粘膜进行免疫组化分析可发现，YAP蛋白质表达水平显著升高，而在上皮细胞层，这种表达上调尤为显著（C图）。而对CD患者的病理表现之一的high-expressed促炎细胞因子IL-1B与YAP的相关性分析，也证明YAP确实在CD发生发展中扮演者一定的角色（D、E图分别揭示了组织与血清中YAP与IL-1B的正相关关系）。至此，在mRNA表达水平和病理表型层面，已证明筛选到的作为转录共刺激因子的YAP分子与CD有着直接的关系。
经过CD患者的验证之后，研究者着眼于IBD，跳出CD的限制，将实验拓展到TNBS诱发的小鼠结肠炎模型，结肠长度的缩短和病鼠体重减轻证明此模型建立成功。接下来，运用qRT-PCR，WB和免疫组化方法（HE染色）证明了相对于对照组，试验组即小鼠模型的YAP的mRNA表达水平和蛋白质表达水平均显著升高。
在以往多个研究中，miRNA已被阐明在CD中具有重要作用。研究者猜想在YAP调节CD的过程中，miRNA也参与其中。此处他们使用了两款生信工具—miRDB and TargetScan（工具会在文末介绍）对可能相关miRNA进行预测。软件筛选出了四种miRNA：miR-200a-3p, miR-141-3p, miR-21-5p, and miR-590-5p，其后着重研究miR-590-5p。
当然，针对miR-590-5p的研究是有条件的-通过对健康人和CD患者结肠活检组织中候选miRNA表达水平检测，只有miR-590-5p的表达量显著下调（B图）。同时在TNBS小鼠结肠炎模型（以下简称小鼠模型）中也验证了这一发现（C图）。其后的实验则证明在CD患者IECs中，YAP表达量与miR-590-5p呈负相关关系（R-square=0.4281），而在患者IECs和血清中，也验证了促炎细胞因子IL-1B与miR-590-5p负相关关系的存在（R-square=0.2751，R-square=0.3738）（D-F图）。这一发现反映了miR-590-5p在CD中调节YAP表达的可能性。
在推定出CD中miR-590-5p与YAP的潜在联系后，研究者用下面一组实验确证了这一猜想。首先可以看到的是miR-590-5p作用于YAP的模式图，miR-590-5p结合到YAP的3’UTR区域下调YAP的表达。研究者使用miR-590-5p模拟物及其抑制剂（B图是对此模拟物作用的验证），对Caco-2和SW620两组结肠细胞癌系进行了功能获得和功能缺失实验（gain-of-function+loss-of-function studies），该实验证明miR-590-5p模拟物的使用可有效降低YAP的表达，相反地，使用anti-miR-590-5p模拟物会使YAP表达升高（CD图），而这则表明miR-590-5p很可能是YAP翻译水平的直接调控因子。而为了进一步验证miR-590-5p是否结合在YAP mRNA 3’UTR区域，研究者构建了两种荧光素酶报告质粒，这两种质粒分别携带WT和YAP 3'UTR突变。
结果表明，高表达miR-590-5p会抑制人YAP野生型3’UTR区域的荧光素酶报告活性，反之亦然（E图）。更重要的是，在3’UTR突变质粒中，实验结果并没有显著不同。这些数据明确解释了miR-590-5p对于YAP的直接调节。
在前面的实验中，已经说明了miR-590-5p和YAP之间的关系，之后，研究者在动物模型上证明了miR-590-5p及其他YAP抑制剂的作用。
首先是小鼠模型经miR-590-5p mimic治疗后的前后形态学对比图，在经过一段时间的观察后，作者给出了对照组和实验组小鼠体重变化比较。除了传统的qRT-PCR技术检测对照组和实验组的小鼠模型YAP mRNA的表达水平，研究者在此引入了病理学评分和MPO水平来反映结肠炎严重程度分级（C-E图）。结肠组织中YAP下游的target包括Ptgs2,Ctgf, and Cyr61，结果表明经miR-590-5p mimic治疗后下游靶标的表达量亦下调。接下来，采用YAP抑制剂verteporfin对实验组进行处理，经过YAP抑制剂治疗后结肠总体形态，长度，体重变化，病理分级，MPO活性等都与miR-590-5p mimic作用结果保持一致（G-J）。
因此，靶向miR-590-5p/YAP轴可有效减轻小鼠模型结肠炎表现。（verteporfin作为YAP抑制剂，可在侧面佐证miR-590-5p mimic针对此结肠炎model的作用，结合前述miR-590-5p/YAP axis，可导出两者之间的作用关系。）
最后，研究者又进一步阐释了CRC中YAP的表达模式，探索YAP-axis是否在CRC中依旧与不良表型产生联系。Oncomine database中诸多队列研究均提示了CRC中YAP的过表达，而qRT-PCR得到的结果表明：在30例CRC患者中，YAP mRNA水平与miR-590-5p有显著的正相关关系。而为了更深层次验证miR-590-5p/YAP-axis在细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和癌细胞侵袭力方面的作用，作者在前述两种结肠癌细胞系中进行了一系列实验（C-F），实验结果也证实了这一猜想，在人类CRC细胞中，miR-590-5p/YAP轴的异常变化确实会导致恶性表型。
总结：
在本研究中，研究者不仅验证了YAP-overexpression在CD中的影响，更证明了miR-590-5p/YAP-axis在IBD以及CRC中的可能作用。而在miRNA研究中，与IBD相关的研究结论已经具有丰富的证据支持，比如miR-122直接靶向紧密连接蛋白occludin从而影响到它的屏障作用；miR-146a和miR-320通过影响各类固有免疫细胞来破坏肠内免疫稳态。miR-590-5p此前多见于各类恶性肿瘤，本研究首次揭示了该miRNA及其下游YAP在CD和CRC中的作用，或可作为IBD与CRC临床治疗的新靶点。
附录：
本研究中涉及到众多RNA-Pro信号通路分析的经典实验方法和在线分析工具，可为有志于此研究的研究者提供一定的参考和灵感，想要了解更多，可戳阅读原文获取文章下载地址。
①筛选软件miRDB与TargetScan：此为两款miRNA靶基因预测工具，使用多个预测工具并取其交集，可得到更为准确的靶基因。教程如下：
http://www.360doc.com/content/19/1222/19/49059453_881421667.shtml
②结肠炎病理评分系统：
https://wenku.baidu.com/view/ 52eb98dcce2f0066f53322e8.html
③CRC：colorectal cancer 结直肠癌
④IBD: Inflammatory bowel disease 炎症性肠病
⑤Oncomine database：涵盖了65个基因芯片数据集，4700个芯片及4亿8千万个基因表达数据的大型肿瘤基因芯片数据库。
⑥miR-590-5p/YAP axis：miR-590-5p/YAP轴，在此文中指Hippo通路中miR-590-5p针对YAP的调控功能。
⑦MicroRNA：miRNA为广泛存在于真核生物中的非编码蛋白质的RNA，具有高度保守型，时序表达特异性和组织表达特异性，可以通过两种方式调节靶基因的表达（注意，此处的调节是针对与其互补的mRNA）：①结合到靶mRNA 3’UTR区，抑制其翻译，②如siRNA作用相似地结合并降解靶mRNA。在过去数十年中，包括miR-301a,20 miR-7,21 and miR-124,22等诸多miRNA已经被认为参与IBD的发生和发展，在未来的研究中可能会成为肿瘤标志物或者治疗靶标。
该论文第一作者为俞旻皓博士，通讯作者为钟鸣教授。上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科-结直肠专业组在学科带头人钟鸣教授的引领下，主要从事结直肠癌和炎症性肠病方面的临床和基础研究工作，课题组从疾病的发生发展机制入手，对肠道菌群、长链非编码RNA，microRNA、肿瘤免疫、类器官培养等均具有较深的研究，承担多项在研国自然面上、青年项目。期待有志于结直肠肛门外科的年轻医学生们加入团队，共攀学术高峰！
编辑：雪娇~
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