非因重磅 | 非因生物发表国内第一篇DSP空间组学技术文章

非因生物发表国内第一篇DSP空间组学技术文章

3月3日，非因生物联合NanoString在肿瘤微环境研究专业杂志《Visualized Cancer Medicine》创刊号上发表国内第一篇DSP空间组学技术文章（https://doi.org/10.1051/vcm/2020002）。该杂志作为国内首个肿瘤微环境专业类期刊，由中国抗癌协会肿瘤微环境专业委员会主任委员、中山大学肿瘤防治中心钱朝南教授，浙江大学转化医学研究院院长吕志民教授和牛津大学医学院肿瘤病理学资深教授Francesco Pezzella共同主编，致力于肿瘤微环境相关的深度学术探索与转化研究。该文章利用DSP空间组学技术对结直肠癌组织的空间蛋白和转录组表达谱进行多组学分析，验证了这一技术的灵敏度和可靠性（图1）。

图1

研究亮点

随着免疫肿瘤学的快速发展和进步，越来越多的研究发现，在保持空间信息完整的情况下对组织实现蛋白质和转录组的共分析，可以为深入研究肿瘤微环境（TME）并阐明生物学机理提供深层次的信息。目前，对靶标的蛋白质和RNA共同分析，已成为分析肿瘤微环境最突出和强大的工具之一。

文章中使用的数字空间多组学分析技术（DSP）是针对肿瘤免疫和肿瘤微环境高精度、多维度分析的新一代数字化空间组学技术，可以在单张切片上通过形态学指导选择兴趣点（Region of Interest，ROI），来实现基于每个ROI微环境的100重蛋白或＞18,000重全转录组的原位表达谱分析，其定量效果、通量和可靠性远超传统的以荧光信号为基础的多重免疫组化与多重免疫荧光技术。

研究思路

首先非因团队利用HEK293细胞系涂片FFPE样本来验证DSP蛋白表达谱实验方法的稳定性。然后选用两片结直肠癌FFPE组织连续切片，分别进行蛋白（40-plex）和RNA（84-plex）的DSP实验，通过形态学抗体染色后把组织划分为五类区域：肿瘤区域、免疫浸润低、中、高区域和正常组织区域，根据染色在每张切片上共选取12个ROI，最后对接nCounter 进行计数定量，以获得组织的空间蛋白组和转录组表达谱数据，进一步验证DSP基于组织检测中的有效性。

研究内容

DSP技术结合了标准免疫荧光和数字条形码定量技术，通过以单细胞水平分辨率的高清组织图像辅助，对多达几十种蛋白和18000多种mRNA进行定量分析。该技术首先将带有不同荧光标记的用以区分组织形态和细胞类型的显型抗体，与核酸标记的靶点抗体（蛋白组）或目标序列的互补序列（转录组），与FFPE组织样本进行原位结合。通过显微扫描获取的荧光形态学图片可以帮助组织病理学判读，让研究者判别肿瘤组织与正常组织以及特定免疫细胞群的区域定位，再通过选取兴趣点（Region of Interest, ROI）将需要分析的特定区域进行划分，通过微米级高精度UV光解技术将不同ROI上的核酸标记解离下来，最后与特异的nCounter系统中的捕获探针和报告探针杂交进行计数定量，来实现对每个ROI中表达谱分析（图2）。

图2

为了验证DSP实验方法的稳定性，文章利用两片同系来源的HEK293细胞系的FFPE切片进行DSP实验。选用包含20靶标的Immune Cell Core Profiling Panel和标准的Morphology panel（包括Pan-CK, CD45, SYTO13），并设置三种直径（200μm，400μm，600μm）规格的圆形ROIs进行验证（图3A）。对于HEK293细胞中已知表达的蛋白，我们选取了两个具有代表性Ki-67和Beta-2-microglobulin，发现不同大小ROIs的nCounter计数与ROIs面积呈线性关系（相关系数达到0.97以上）（图3B）。紧接着对两张切片蛋白谱进行比较分析，未检测到两张切片间有显著差异的蛋白（图3C）。上述结果均表明DSP实验方法有较高的可行性以及DSP系统较好的稳定性。

图3

接着非因团队进一步验证了DSP在基于组织样本切片中的有效性，选用两片结直肠癌FFPE组织连续切片，分别进行蛋白（40 plex）和RNA（84 plex）的DSP实验。根据荧光显色结果，选取每张切片不同组织病理学区域的12个ROIs（圆形ROI直径300um），标注为不同的组以便后续的聚类分析（图4A）。文章选取了两张切片基本相同位置的ROIs，以确保后续蛋白和RNA的原位比较。对蛋白和RNA的数据进行无监督层次聚类分析，同一分组内的ROIs可以聚集到一起（图4B和4D）。这一规律同样在在PCA图中体现：Tumor和Stroma分组可以明显区分开（图4C和4E）。以上结果再一次证实了DSP系统的稳定性和可靠性。

图4

文章总结

非因生物凭借在癌症蛋白组学与系统生物学研究中的独特优势，于2019年在中国率先建立了第一个DSP技术平台，成为全球8个DSP技术服务中心之一，首次将DSP空间组学引入中国科研工作者的视线。

文章介绍了DSP平台常规的操作流程，并验证了这一新型技术平台预期的灵敏性和稳定性。作为一种高度复杂的空间分析新技术，DSP从肿瘤微环境的角度赋予了精细的分析能力，并在相对较低的细胞输入水平上扩展到更多可分析的目标。我们期待DSP技术平台将极大的推动生物医学研究，尤其是在免疫肿瘤学和肿瘤微环境领域发挥重要作用。