ELISA实验假阳性的五大元凶？

  ELISA被广泛应用于农业、养殖业、食品安全等领域，是一种灵敏度高、特异性强、操作简便的检测方法。

  在实际应用中，ELISA操作的各个方面均对结果产生影响，如移液器的使用、样本存放、加样、溶血、试剂温度等。除此之外，一些非主观因素也会对结果造成较大的偏差。

  ELISA实验中的假阳性结果，让各位“江米”们头都大了吧？欲哭无泪吧？今天小编和各位一起分享导致ELISA实验假阳性五大因素！

内源性因素

1、年龄因素

  老年人容易出现免疫功能异常，产生一些异常蛋白质干扰了检测的结果出现假阳性。

2、疾病因素

  类风湿关节炎、红斑狼疮、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者体内含有嗜异性抗体，自身抗体、类风湿因子等，这些特殊成分在反应过程中有一定的吸附作用，多为体内某些抗原物质干扰所致产生假的显色反应而出现假阳性。

标本因素

1、标本处理不彻底

  血液抽出后未完全凝固而离心分离血清不能使纤维蛋白原完全析出，加样后板孔中形成纤维蛋白薄膜或絮状物，造成洗板不彻底干净，酶残留在反应孔中，使反应孔吸光度值偏高，出现假阳性，待测血清中混有纤维蛋白原，这种物质易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，试验表明在较高的离心转速（3000/min）和较长的离心时间（>10/min）之上，血液标本被充分地离心分离后，使红细胞和纤维蛋白充分沉淀，可以在加样时避免加入这两种干扰物质对试验结果的影响。

2、标本溶血

  标本溶血时细胞内液的各种活性酶以及具有酶活性的物质与底物非特异性结合，洗涤时不易洗去，催化底物产生一定的显色反应，使本底吸光度值偏高形成假阳性。

3、细菌污染

  标本放置、处置不当被细菌污染，一些细菌体内可能含有内源性辣根过氧化物酶会对相应的酶做标记的测定方法产生非特异性干扰，造成弱的假阳性反应。

操作因素

1、加 样

  对于间接ELISA标本一般都要进行稀释，如果加样不准就会造成误差，尤其当稀释倍数大时，很小的误差，会导致较大的相对误差，使阴性（或弱阳性）标本呈阳性（或阴性）。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。目前，大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本，可较好地避免以上误差。

2、洗 涤

  在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关键一步，应引起操作者重视。无论是手工操作还是机器操作，得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关，ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。

3、温 育

  每种试剂都有其最合适的反应模式，其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高，反应时间长，会造成整板本底高，阳性率高。温育一般用湿盒或水浴，反应板不宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖。

仪器因素

1、酶标仪

  作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养，对滤光片要定期校正；其次酶标仪波长设置要正确，最好使用双波长，一个检测波长，一个参比波长，以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。此外，在用酶标仪读数时最好先擦拭微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。

2、波长选择

  酶标仪的波长选择，建议酶标仪比色时选择双波长，即敏感波长（主波长）和非敏感干扰波长（次波长），最后从仪器上得到的读数为敏感波长与非敏感干扰波长之差，排除（板孔的划痕、污迹）干扰。

方法学因素

1、试剂盒选择

  由于不同厂家的试剂盒所包被的抗原配比以及抗原纯度不尽一致，造成灵敏度和特异性不同，因此也造成了假阳性或假阴性的产生。实验中，不同厂家的ELISA试剂盒不要混用。

2、实验灰区

  在阳性与阴性之间有一条明显的分界线，作为阳性判定值（cut-off）来判定结果，一般把检测值S/COV值（样本吸光度值比临界值）在0.6-1范围内时作为灰区带，因此当1＜S /CO≤0.6时，真反应性显色的可能性小，多为体内某些抗原物质干扰所致，实验室检测人员应依据实验检测结果，结合受检者相应病史和个体状况进行综合分析，应进行确认实验，避免判定假阳性。

3、钩状效应

  钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。钩状效应的产生，需对标本进行稀释重复检测。

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  文章来源于江莱生物（shjianglai666）