实验进程&PCR和跑胶介绍

       转眼间，暑假已经过半，我们的实验工作也已经开展了半个多月了！大家肯定会很好奇，在这短短半个月中，我们都完成了什么。那么今天，就跟着我们一起看看我们都完成了什么工作吧！

       首先是项目的背景调查。详细内容可以去看我们上一篇文章哦！

       在确定了主题是改造解脂耶氏酵母，使它可以利用陈化粮制造生物柴油之后，我们便开始了设计bio-Brick，将我们所要的基因片段从其他细胞中提取出来，统一使片段具有统一的组装接口。然后就可以像积木一样简单地组装了。

       在我们的项目里，总共设计了7个bio-Brick，分别是两个promoter（启动子，用来启动基因片段的表达），两个terminator（终止子，用来终止基因表达），两个基因片段（分别表现为分解淀粉和葡萄糖），和一个筛选基因（用来筛选出成功转化遗传基因的细胞）。为了要多次试验提高成功率，降低成本，我们采用了PCR技术，以扩增我们所要的基因片段。

PCR技术是什么？

PCR技术，又称聚合酶链式反应。是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点，也是最神奇的一点，是可以将微量的DNA大幅增加（比如远古生物的DNA，哪怕只有一点点，通过PCR技术也可以将其大量扩增，进行对比）。（*参考百度百科）

PCR技术的原理是什么？

简单来说，就是体外模拟生物体的DNA复制

而整个程序分为四个阶段：预变性、变性、退火、延伸 

（1）&（2）DNA双链在高温下完全解旋，变成单链DNA（预变性&变性）

（3） 引物结合在单链DNA上（退火）

（4） 在DNA聚合酶存在下，向外延长，最后合成目的片段（延伸）

在完成了PCR扩增后，我们就要开始验证所得DNA条带是否是我们需要的目的条带，大小是否正确。这里是我们主要完成的工作的第二个部分—琼脂糖凝胶电泳，简称跑胶

跑胶用到的材料有：琼脂糖，TAE缓冲液，核酸染料，Buffer，DNA marker

跑胶过程（大致）：

（1） 配胶：取一定量的琼脂糖于500 mL容量的三角瓶中，并加入TAE缓冲液，于微波炉中进行加热，使得琼脂糖全部溶解。

（2） 加入核酸染料，摇晃均匀。溶解液倒入插入梳子的胶盒，等待直到胶凝固。

（3） 胶轻轻放入电泳槽，并使TAE将胶完全浸没。

（4） 点样：取PCR溶液，加入Buffer，混匀后点入胶孔。同时在胶孔点入一个marker做验证。

（5） 打开电泳槽开关，30min后关闭电泳槽。

（6） 把胶拿到紫外下进行照射。验证条带大小。

那么跑胶的原理又是什么呢？

首先，让我从原料来给大家普及下吧！

琼脂糖凝胶，以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。最早被人们在一种藻类中发现，并成功提取。这种材料非常神奇，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。

*电渗现象：由于琼脂糖凝胶为多孔状，不带电荷，而其中的溶液在电场之中相对带电，溶液会向一边渗透。

TAE缓冲液、Buffer，都为缓冲剂，使溶液带电

核酸染料可以使最终的跑胶结果在紫外线下呈现

DNA marker：作为跑胶的对照，判断最终的DNA条带的大小是否正确。

跑胶的“核心”原理：由于琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，（大分子物质在涌动时受到的阻力大，小分子所受阻力小）因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力；同时，蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。

最后，我们将电泳完毕的胶块放置紫外灯下，由于胶和要验证的PCR产物中都加入了染料，故最后呈现出来的样子：（其中对照中不滴加任何模板，故没有条带）

以上就是我们两周来主要做的实验！

/其实，to be honest，我们一直在重复提取bio-Brick中的两个基因片段。提取时，一直无法提取到正确排序的片段（如，最近的一次，金属离子基本合格，可在测序时发现排序出现了变异）...

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