单细胞测序3 丨丨构建文库

上期分享了单细胞测序2丨丨细胞捕获&cDNA扩增，主要介绍了单细胞测序第二环节--基因表达实验流程：GEMs形成、mRNA逆转录、二链cDNA合成与扩增。接下来进入单细胞测序的第三环节--文库构建。文库构建可分为三个部分：DNA片段化/末端修复/添加A尾、接头连接和Index PCR（PCR富集）。

1.DNA片段化/末端修复/添加A尾

1.1 DNA片段化

DNA片段化主要通过物理方法（超声、加热）或者酶切的方式将大片段的DNA随机打碎成小片段DNA。其中酶切法有一定的偏好性，打断的DNA片段大小在1kb以下，例如：200bp、350bp、500bp等，但是操作简单，节约时间。

1.2 末端修复

片段化后的DNA链存在缺口，两端均是粘性末端，需要通过末端修复反应，将片段化后的DNA的3'凸端切除，以及将5'凹端补平，转化成含有5'-磷酸基和3'-羟基的平末端DNA。

1.3添加A尾

随后对DNA的3'末端加dA，转换为粘性末端，用于后续与adapter互补配对；并对DNA的5'末端进行磷酸化。

2.接头连接

随后对修复后的片段进行接头连接，主要是利用DNA连接酶，将3'端带有dA的DNA片段与adapter接头进行连接。接头的分类有两种方式：

2.1单端Index&双端Index

可根据Index位置不同，将接头连接的方式分为单端Index&双端Index。单端Index指的是构建好的文库序列，仅在P5或P7端存在Index结构； 双端Index指在P5和P7端都存在Index结构。

2.2长接头&短接头

也可根据接头是否匹配PCR free建库的要求，将接头分为长接头（完整Y型接头）和短接头（非完整Y型接头）。长接头包括P5/P7+Index+Read1/Read2序列，可通过TA克隆连接到DNA片段后，形成完整的文库结构，若文库产量足量时，可不进行PCR扩增直接上机测序。短接头只包含Read1/Read2序列，通过TA克隆连接到DNA片段后，需要通过PCR扩增将P5/P7和Index序列引入文库结构中，形成完整的文库结构后进行上机测序。

3.PCR富集（Sample Index PCR）

对接头连接后DNA片段进行PCR扩增，扩增的产物含有大量原始模板的正反链的Insert Fragment，随后对PCR产物进行磁珠纯化，纯化后合格的产物可用于高通量测序。文库结构如下：

4.文库质控

纯化后的PCR产物，需要进一步浓度和片段大小检测。其中浓度能达到上机测序要求即可；片段大小必须满足：片段范围为300-700bp，主峰在450-550bp；无接头片段和大片段污染。质检合格的产物可用于高通量测序。

                                              单细胞平台-百创DG1000

百创DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode标记等技术来实现高通量的细胞捕获。除了仪器以外，百创DG1000还有配套的2×4的独立芯片及配套试剂盒。

                                                        结果展示

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人乳腺癌

某鱼类食道

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