深度好文 | 单细胞测序技术揭示小鼠表皮损伤修复过程中成纤维细胞异质性

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11月文献解读：Guerrero-Juarez, C. F., Dedhia, P. H., Jin, S., Ruiz-Vega, R., Ma, D., Liu, Y., ... & Kessenbrock, K. (2019). Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature communications, 10(1), 650.

        皮肤主要由最外层的表皮及其下层富含胶原蛋白的真皮组成，其中表皮提供屏障作用，真皮使皮肤具有机械强度，同时容纳表皮的附属物（包括毛囊和汗腺等）。皮肤产生损伤之后的修复过程会经历毛囊和皮肤脂肪细胞的再生，但是关于再生细胞的来源仍知之甚少。来自美国加州大学欧文分校的Maksim V. Plikus研究组于2019年2月在Nature Communications上发表了题为“Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds”的研究文章，揭示了小鼠皮肤损伤修复过程中成纤维细胞的异质性以及髓细胞转化为新生脂肪细胞的过程。

        研究人员选择了6到8周龄的小鼠，在背部进行全层切除术产生长为1.5cm的伤口，12天之后取伤口周围组织进行单细胞测序分析。经过质控和聚类分析后鉴定到13个细胞类群，其中成纤维细胞占全部细胞数量的65%，高表达的基因包括胶原蛋白基因以及细胞外基质蛋白基因。

图1 a/b/c/d/e/f. 损伤组织单细胞测序与细胞类型鉴定

        对所有的成纤维细胞进行了二次聚类，得到12个类群。对12个类群细胞的表达谱进行分层聚类，发现C11、C3、C9三群比较像，属于Pdgfra低表达细胞，其他9群属于Pdgfra高表达细胞，这一部分又分为Crabp低表达的4群与Crabp高表达的5群。通过免疫染色观察不同细胞在皮肤伤口中的位置，发现Pdgfra+Crabp+细胞主要分布在真皮偏上的表皮部分，而Pdgfra+Crabp-细胞主要分布在真皮偏下部分，Pdgfra-细胞则在真皮位置广泛分布。

        采用拟时间分析对亚群间的转化关系进行探究，发现分化曲线的左侧基本都是Pdgfra+细胞，右侧是Pdgfra-细胞。采用了RNA速率（RNA velocity）的方法对细胞的转化方向进行预测，鉴定到3条转化路径，其中path1表示了从Pdgfra+细胞向Pdgfra+Crabp+细胞的转化，path2表示了从Pdgfra-细胞向Pdgfra+Crabp+细胞的转化，path3表示了Pdgfra-细胞内部不同状态间的转化。

图3 a/b. 成纤维细胞拟时间分析

        另外观察到一部分成纤维细胞也表达造血细胞的marker gene，比如巨噬细胞的Lyz2。同时这些细胞在肌成纤维细胞的收缩性marker（Acta2和Tagln）上也存在重合表达。为了验证这些肌成纤维细胞是不是来自组织驻留的髓细胞，研究人员对髓细胞和表达髓细胞marker gene的成纤维细胞一起进行了拟时间分析，发现髓细胞和成纤维细胞分布在分化曲线的两端，中间部分是两种细胞的重合，这部分细胞同时表达髓细胞与成纤维细胞的marker gene。RNA速率分析显示存在4条明显的转化路径，其中path3横跨了髓细胞和成纤维细胞的重合区域，反映了伤口驻留的髓细胞向成纤维细胞转化的过程。

图4 e/f/g/h/i/j. 表达髓细胞marker gene的成纤维细胞拟时间分析

        研究人员单独将肌成纤维细胞分选出来进行了单细胞测序以及单细胞Western blot实验。共鉴定到3个亚群的肌成纤维细胞（fc1-fc3），其中fc3细胞同时表达髓细胞与肌成纤维细胞的marker gene。Western blot实验结果显示，在部分细胞中存在髓细胞和肌成纤维细胞marker gene蛋白的共表达。这些结果说明在损伤修复过程中确实产生了一群带有髓细胞表达特征的肌成纤维细胞，可能是从伤口驻留的髓细胞中分化过来的，并进而在伤口愈合的过程中发挥作用。

图5 a/b/c/d/e/f. 肌成纤维细胞单细胞测序分析

        之前有研究显示损伤修复过程中新生的脂肪细胞主要来自于肌成纤维细胞，因此研究人员推测可能是髓细胞首先分化形成肌成纤维细胞然后进一步形成脂肪细胞。构建了骨髓移植小鼠模型对此进行验证，对小鼠进行了全身致死辐射之后，移植了不同类型的细胞观察其在伤口修复中的作用。首先是移植了多能造血干细胞的小鼠，在伤口形成28天之后观察到新生毛囊附近的绿色荧光，但是在移植了Cd45neg造血细胞的小鼠伤口附近没有观察到荧光。采用流式细胞计数的方法统计，在28天和2个月之后，伤口组织中来自供体细胞的比例仍然在30%左右，说明确实有一部分细胞迁移到伤口部位转化成成纤维细胞。

图6 a/b. 骨髓移植小鼠模型探究成纤维细胞来源

        最后通过脂肪细胞marker gene（Retn）标记的造血干细胞移植验证脂肪细胞的来源，发现移植了造血干细胞的小鼠在新生的毛囊附近表现出报告基因的表达，而移植了Cd45neg造血细胞的小鼠没有表现出报告基因的表达，说明伤口愈合时新生的脂肪细胞确实有一部分来自于造血细胞。

图7 c/d/e. 骨髓移植小鼠模型探究新生脂肪细胞来源

        总的来看，文章通过单细胞测序技术对皮肤损伤修复过程中成纤维细胞的异质性进行了揭示，并通过免疫染色研究了不同亚群细胞所处的组织位置；通过拟时间分析研究了不同细胞间的转化关系，发现髓细胞可以转化为肌成纤维细胞，并对髓细胞和肌成纤维细胞的marker gene进行了共染实验进行验证；最后通过一系列骨髓移植小鼠模型验证了从髓细胞到肌成纤维细胞再到脂肪细胞的分化过程。文章的技术路线比较清晰，研究方法值得借鉴。