华西医院研究团队建立滤泡性甲状腺癌诊断的血浆胞外囊泡分类器

滤泡性甲状腺癌(Follicular thyroid carcinoma, FTC）约占临床表现甲状腺癌的10%，其易发生血行性扩散。2024年1月，Br. J. Cancer（IF: 8.8）杂志在线发表了一篇题名为“Circulating small extracellular vesicle-based miRNA classifier for follicular thyroid carcinoma: a diagnostic study”的研究文章，研究人员比较了血浆细胞外小囊泡(sEV）RNA和游离RNA（cfRNA）的诊断特性，基于5个miRNA开发了循环sEV miRNA（CirsEV-miR）分类器，该分类器可以很好地识别FTC患者，可作为一种无创方便、特异稳定的辅助检查。

该研究主要内容包括：

①来自单一中心（华西医院）的21例FTC患者和20例滤泡性甲状腺腺瘤（FTA）患者被纳入训练队列(n = 41），根据RNA测序筛选结果，基于5个miRNA开发了循环sEV miRNA（CirsEV-miR）分类器。

②来自四家医院（华西医院、华西第四医院、华西天府医院和四川省肿瘤医院）的验证队列(n = 150），包括50例FTC患者和100例FTA患者，通过qPCR方法进行CirsEV-miR分类器验证。

 研究结果

1、循环细胞外小囊泡(sEV）RNA和游离RNA（cfRNA）测序分析

为了鉴定潜在的循环RNA生物标志物，每个血浆样本被分成两份：一份用于sEV RNA测序，另一份用于血浆cfRNA测序。结果表明sEV longRNA、sEV miRNA和cf longRNA的诊断能力相当，cf miRNA的诊断潜力较差。考虑sEV miRNAs可能由于膜结构保护而稳定，并且比循环系统中的长RNA更容易检测，相对更加便于后续临床应用，研究人员选择诊断潜力最大的前10个sEV miRNA进行了后续研究。

图1 循环小细胞外囊泡(sEV）RNA和无细胞RNA（cfRNA）测序分析

2、sEV miRNA分类器的构建与验证

在训练队列中进一步通过qRT-PCR检测候选sEV miRNA，证实5个sEV miRNA在FTC组上调。ROC分析结果提示表现最好的是miR-127-3p，AUC为0.889。进一步整合两个或更多的miRNA以进一步提高诊断性能，发现整合5种miRNAs（miR127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p）的AUC最高，定义其为CirsEV-miR分类器。

研究人员在验证队列中进一步证实这5种sEV miRNA的差异，总FTC、微创FTC（mi-FTC）、包封血管侵入性FTC（En-FTC）和广泛侵入性FTC（Wi-FTC）的AUC分别为0.844、0.824、0.821和0.929，表明CirsEV-miR分类器不仅对总的FTC具有诊断价值，而且适用于不同的FTC亚型。此外，FTC的CirsEV-miR评分显著高于FTA，并随着肿瘤负荷（TB）的增加而增加，且CirsEV-miR评分较高的FTC患者更有可能患有晚期疾病。通过分析10对来自甲状腺切除术和放射性碘治疗前后一个月的FTC远处转移患者的血浆样本，发现与对照相比，大多数患者术后/治疗后血浆sEV miRNA水平显著降低。综上所述， CirsEV-miR分类器可能是一种鉴别诊断FTC的有效方法。

图2  sEV miRNA分类器的构建与验证

3、CirsEV-miR分类器中miRNA的平行性、稳定性和功能分析

研究人员在细胞系、类器官和组织sEV中验证了CirsEV-miR分类器中miRNA表达，结果显示FTC类器官和组织来源sEV表达了更高水平的miRNA，FTC细胞系培养上清sEV miRNA水平也高于正常甲状腺滤泡上皮细胞系，结果与循环sEV miRNA水平一致。通过RNA酶处理和温度冻融实验证实了FTC血浆sEV 中miRNA的稳定性。进一步，评估CirsEV-miR分类器中miRNA的功能，发现其靶基因不仅在生物过程（如细胞多糖代谢过程和器官或组织特异性免疫反应）和分子功能(如细胞因子活性和肿瘤坏死因子受体结合）中显著富集，还在与肿瘤发生相关的通路中显著富集（如Wnt和Hippo信号通路），提示分类器中的miRNA可能参与了FTC的发生和发展。

图3  CirsEV-miR分类器中miRNA的平行性、稳定性和功能分析

4、CirsEV-miR分类器改进了当前手术策略

最后，研究人员评估了结合CirsEV-miR分类器的临床分析是否会改善手术策略，发现如果使用现有的工具来指导手术干预，28%的FTC病例将不会进行手术，然而加入CirsEV-miR分类器时，所有患者在诊断时都能被正确识别。因此，通过CirsEV-miR分类分析，FTA患者不会考虑手术，而FTC患者会在第一次手术干预时进行全甲状腺切除术。综上所述，该分类器作为生物标志物的加入改善了当前的手术策略。

图4  CirsEV-miR分类器改进了当前手术策略

总结与讨论

滤泡性甲状腺癌(FTC）手术前的诊断仍然是临床的主要挑战。这项研究训练组和验证组分别纳入41例和150例样本，在训练队列中，通过RNA测序比较了sEV相关RNA和cfRNA的诊断特性。结合PCR进行验证，鉴定出了高质量的候选基因，构建了FTC的CirsEV-miR分类器（miR127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p），并在验证队列中进行验证。该分类器可以很好地识别FTC患者，CirsEV-miR评分与肿瘤负荷显著相关，并且来自FTC细胞系、类器官和组织的sEV miRNA的水平也较高，CirsEV-miR分类器作为生物标志物的加入改善了当前的手术策略。综上所述，CirsEV-miR分类器可作为一种无创、方便、特异性和稳定的辅助方法来促进FTC和FTA的区分。

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相关文献

Li G, et al. Circulating small extracellular vesicle-based miRNA classifier for follicular thyroid carcinoma: a diagnostic study. Br J Cancer. 2024.

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