课程内容
3.1.核酸的物理化学性质
3.2. 核酸的一级结构
3.3. 核酸的二级结构
3.4. DNA supercoil
3.5 RNA二级结构
C主要知识点
专业名词
Tm; C0t
Hoogsteen 碱基对
四链DNA quadruplex DNA
DNA复性 DNA Renaturation
DNA变性DNA Denaturation
DNA超螺旋 DNA supercoil
C值 C-value
A-型双螺旋 A-DNA
B-型双螺旋 B-DNA
Z-型双螺旋 Z-DNA
拓扑异构酶 Topoisomerase
核酶 Ribozyme
核酸的分子杂交
二代测序技术 （Next generation sequencing）
理论与实验
1) Sanger测序的原理
2) 二代测序的方法
3) 影响DNA变性的因素
4) C-Value Paradox
从本次课到第8次课，均是讲述DNA相关的知识。核酸的结构开始，到DNA如何组装为染色体，基因组学（5-6），DNA复制（7-8）。
3.1. 核酸的物理化学性质
学习该部分，希望同学们掌握描述DNA或是RNA时，常用的理化参数或者名词有哪些；还有就是关于核酸的常识。
当我们谈到核酸时，一般会关注GC含量、Tm值、大小（长度）。
1). GC含量。一个核酸分子中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率称为GC含量。在DNA中，GC含量愈高，DNA的密度也愈高；形成的双链愈稳定，因此热及碱不易使之变性。根据这一特性，可进行DNA的分离或测定。此外，对生物的基因组DNA来说，GC含量是一个固定值。
2). Tm值。
与此相关的是核酸的变性和复性。
DNA在物理或化学因素作用下(如加热、酸碱或紫外线照射)，可以导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键(如磷酸二酯键、糖苷键等)则不受影响，称为DNA变性 (DNA denaturation or DNA melting)。凡能破坏双螺旋稳定的因素（如加热、极端的pH、有机试剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等)均可引起核酸分子变性。比如，PCR中，会使用90度以上的高温让DNA变性；分析RNA时，会用65度进行RNA的变性；Southern blotting中，会用0.4N的NaOH对凝胶中电泳分离的DNA进行变性。
Tm值，就是让一半的DNA分子发生变性时的温度。DNA的Tm值由以下几个因素决定：（1）GC含量，在一定条件下Tm高低与DNA分子中的GC含量成正比，G-C含量高时，Tm值比较高，反之则低。这是因为G-C之间的氢键较A-T多，解链时需要较多的能量之故。（2）DNA长度。DNA所处的溶液条件，影响因素包括离子浓度、pH值和有机溶剂。
DNA复性。复性（renaturation），也称退火（annealing），就是两条单链DNA分子之间依据Waston-crick碱基互补配对的规则，变成双链的过程。复性的最佳温度一般在比Tm低25度左右。此外，如果将DNA高温变性后，立刻放在冰上降温，DNA会保持变性的单链状态，(称为淬火，quelling）。同DNA变性一样，影响DNA复性的因素包括：DNA浓度、复性的时间、DNA序列的复杂度等。鉴于DNA的复性的时间与DNA复杂度有关，因此可以通过用C0t值来描述DNA序列的复杂度。序列复杂度低，重复序列多，复性就快，C0t值低；复杂度高，复性慢，C0t就高。
DNA的变性和复性是许多实验的基础，比如PCR和分子杂交实验。例如我们在PCR中遇到高GC含量的模板时，DNA变性可能不完全，会利用一些添加剂来降低Tm值，提高PCR效率。这次课的作业就是与此有关。
另外就是经典的分子杂交实验。分子杂交：指两条单链核酸分子间复性变为为双链的过程。分子杂交技术，利用DNA变性、复性来检测核酸的技术。分子杂交可以发生在DNA单链之间，也可以是DNA单链和RNA之间，或者RNA之间都可以进行分子杂交。2）复性的两个DNA或RNA单链之间，序列可以不完全一致。比如DNA引物与模板之间有一个错配，实际上也能结合为部分双链（如DNA二级结构中的R型环突，R-loop）。
Southern blotting（Southern印迹）
1975年由英国人southern创建，是检测DNA和绘制DNA图谱的基本技术。其基本原理是：具有一定同源性的两条单链核酸在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。其中一条链是固定在支持物上的待检测DNA，另一个是用同位素标记（或其他方式标记）的DNA单链（即探针）。在实际操作中，一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的待检测的DNA样品，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与序列已知的探针进行杂交，用放射自显影（或酶反应显色）来检测探针是否与目标样品结合，从而检测样品中是否具有和探针同源的序列。
Southern杂交一般用来检测目标DNA序列（基因）在待分析的样品中是否存在。例如转基因作物的检测。同时还可以知道目标序列经酶切后的大小，从而绘制目标DNA区段的图谱（DNA指纹）。
另外还有，Northern blotting （Northern 杂交），用DNA或者RNA探针检测RNA分子。过程和原理与Southern blotting一样。
3). DNA大小。
核酸的大小主要用碱基对（base pair，bp）来表示。常用的单位有Kb (kilo base pairs)，Mb (mega base pairs)，Gb (giga base pairs) 等。在这部分中，需要了解C-值悖论。
不同生物，基因组DNA的大小差异非常大，从只有几千bp的病毒到十亿以上碱基对的植物、动物。一般将单倍体基因组总DNA的含量可作为一个物种的特征，称为C值。按照常理推断，DNA的碱基多，携带的信息就多，基因的数目就多，能够完成的生命活动也会更复杂。在低等生物中的确存在这样的规律，一个物种的DNA多，往往编码的基因就多，能够适应更复杂的自然环境。但在真核生物中，DNA含量的和它编码基因的数目是没有严格的关联，和生物进化的复杂性也没有严格的对应关系。比如，青蛙的基因组是人的7倍；在植物种，拟南芥基因组只有100多Mb，水稻是400Mb左右，玉米和小麦是Gb以上，但这几种植物的复杂性、进化的程度，其实是等同的。这就引出了C值悖论（C-value paradox），即一个物种的C-值与它的进化没有严格的对应关系。
要完整的回答C-value paradox，可能等大家学完基因组学以及后面的课程，才能系统地解释出现C-值悖论地原因。简单的说，C-值大地物种中可能有大量的非编码DNA，还有就是大量的重复序列（如转座子），因此C值虽大，但并没有包含更多地基因（或是编码更多的蛋白）。那是不是这些非编码DNA和重复区域就是不需要的，是基因组上的“垃圾DNA”，这个问题不容易回答。我们在研究中确实发现有些DNA区域，或者一些有些不表达的重复基因，去掉以后对植物没什么影响。但大家回忆一下第一次课的小幽默。遗传学家将“安全带”去掉，正常情况对汽车的行驶不会由任何影响，只有在撞车时才会发现它是必要的。我们现在将某个基因或某段DNA去掉，并不能完全确定对植物没有影响，也许是在特定条件下才会出现；当然，有一些DNA的确就是“进化”的遗迹，是可以抛弃的。
3.2 核酸的一级结构
DNA的一级结构是指各个核苷酸结构单元或碱基的排列顺序，存储了生物的遗传信息。此部分的重点是学习DNA测序的原理。
1）Sanger测序
最经典的是Sanger测序，也称链终止测序（chain termination method）。它利用DNA合成反应过程中，双脱氧核苷酸的加入使DNA链的合成终止，将终止的DNA链电泳后，来读取DNA序列。
1.进行四组平行反应, 每一组反应混合物含有四种dNTP, 每一组反应含有一种少量的ddNTP
2.进行DNA合成反应。在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸；有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止。每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。
3.对每一组反应混合物进行凝胶电泳。DNA片段将按大小分离。片段越短，电泳越快，就越靠近凝胶的底部
4.序列读取。对凝胶电泳进行放射自显影，从凝胶的底部向上读出序列
我们一般使用的是自动化sanger测序仪，用四种不同的荧光分子，分别标记ddATP、ddCTP，ddTTP和ddGTP。测序反应后，利用激光扫描仪直接读取荧光分子的颜色，获得碱基信息。（视频： https://v.youku.com/v_show/id_XMjk5ODA3ODc2MA==.html?spm=a2h0k.11417342.soresults.dtitle）
2). 二代测序方法
即使自动化的Sanger测序，在前期需要大量的准备工作，并且测序通量有限，一次电泳也只能进行384个片段的测序反应。2005 年 Roche 公司发布的 454 测序系统标志着测序技术跨人高通量并行测序的时代。第二代 DNA 测序（next generation sequencing，NGS）技术又称大量并行测序技术(massive parallel sequencing,MPS)、高通量测序技术(high—throughputsequencing,HTS)。
NGS其特点是一个反应能同时测定成千上万的DNA片段的序列，但读取序列的长度有限。最早只能读取几十个碱基对长度的小片段，到现在能够并行读取300-500bp的DNA片段的序列。对于不同的测序技术，需要同学可以去查阅资料，到各个测序公司的官网了解这些测序方法的原理和性能。这里这是点到为止。
焦磷酸测序（pyrosequencing）, 454测序仪。加入某一核苷酸时，检测DNA合成时是否产生PPi（焦磷酸）来判断碱基序列。
Illumina/Solexa测序：荧光标记和分子阵列。即在一张芯片上同时进行大量的类似Sanger的测序反应。由于使用的末端终止世纪时可逆的，在完成一个碱基的读取后，可持续进行DNA链的延伸和测序。
Ion Torrent测序（半导体测序）：利用半导体芯片捕获DNA合成过程中产生pH值的变化。
3). 三代测序
即单分子测序技术，在测序过程中不需要涉及PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。三代测序技术具有超长读长，还拥有不需要模板扩增、运行时间较短、直接检测表观修饰位点、较高的随机测序错误等特点。它弥补了第二代测序读长短、受GC含量影响大等局限性，已在小型基因组从头测序和组装中有较多应用。包括以下几个公司的技术。
Helicos （最早，2012年破产）
OxfordNanopore 纳米孔测序（Nanopore）
Pacific Biosciences的SMART测序，PacBio测序
3.3. 核酸的二级结构
DNA的二级结构主要是各种形式的双螺旋，除了最常见的B-型双螺旋，此外还有A-型双螺旋、Z-型双螺旋。B-型双螺旋也就是Watson和Crick提出的DNA结构模型，是生物体内DNA的主要形态。DNA还存在三链螺旋和四链螺旋。由于DNA的特殊性质，DNA可以组装成各种二级结构的纳米材料（DNA Origami）。我们感兴趣是有生物学意义的核酸结构。
在DNA复制， 转录，重组等阶段，双螺旋DNA还能形成多样的二级结构，比如分支型的DNA（在DNA修复中会出现），DNA复制时形成Y性的复制叉等
部分特殊的DNA序列哈能形成三螺旋DNA和四股螺旋DNA。
三股螺旋DNA
四螺旋DNA，也称G-quadruplex，在GGG重复序列组成的DNA链中容易形成的四螺旋DNA，发现于端粒、启动子等区域。近年研究发现G-quadruplex可能具有非常广泛的生物学功能，参与转录、翻译等环节的调控。
3.4 核酸的三级结构
在细菌、病毒、真核细胞线粒体、叶绿体中，DNA多呈现双链环状分子，是没有自由末端的闭合双链结构（covalently closed circle DNA， cccDNA）。DNA分子可以在双螺旋的基础上，进一步绕同一中心轴扭转，造成额外的螺旋。形成超螺旋的结构。超螺旋本身具有方向性，因此当旋转方向不同时，可产生正超螺旋和负超螺旋两种形式的拓扑结构。右手超螺旋（顺时针），称为负超螺旋（与DNA双螺旋的旋转方向相反的扭转）；反之形成的左手超螺旋（逆时针）称为正超螺旋（与DNA双螺旋的旋转方向相同的扭转）。
在生物体内，DNA主要以负超螺旋的形式存在，并通过拓扑异构酶来调整DNA的超螺旋结构。DNA超螺旋与DNA复制和转录都有关（可见DNA复制部分）。
真核生物染色体虽然是线性分子，但其DNA与蛋白质相互结合，以许多大环的形式存在，许多个环的基部聚合在一起形成类似环的结构。此外，真核生物DNA在细胞中高度压缩成染色体结构，在后面的章节中会介绍。
3.5 RNA的二级结构
RNA为单链，非常容易分子内或是分子间形成双链，进而形成各类二级结构。RNA的二级结构跟它的功能有密切联系，比如核糖体RNA、snoRNA、tRNA的二级结构，siRNA来源于双链RNA，miRNA来源于同一个RNA分子形成的stem-loop结构等。这节的另外一部分内容就是希望大家熟悉各类RNA相关的名词。