DNA甲基化分析②数据质控

质控原则

好的结果需要好的数据。
原始下机测序数据(raw data)中，有些reads包含有测序接头序列，这些序列不属于测序物种中的原有序列，因此质控过程中需要剪切去除。同时，下机数据中还包含许多低质量的reads序列（如平均测序质量值较低的reads,序列某些位置碱基质量值过低，含N较多的reads等），同样需要过滤去除。
质控核心思想：trim(剪切)+fliter(过滤)

软件

使用fastp和fastqc作为质控软件。fastp主要用来剪切和过滤reads，fastqc用以生成更详细的质控报告。

fastp参数选择

文件读写及程序运行基本选项：
-i，输入文件1，双端测序raw reads R1；
-o，输出文件1，双端测序clean reads R1；
-I，输入文件2，双端测序raw reads R2；
-O，输出文件2，双端测序clean reads R2；
-6，输入fastq文件phred格式为phred64，将其转化为phred33，输出fastq文件phred33；
-z，gzip压缩水平，取值1-9，数值越高压缩空间越小但速度越慢，默认为2；
-j，输出的json文件名称，默认fastp.json；
-h，输出的html文件名称，默认fastp.html；
-w，程序运行线程数，默认3线程；
-s，可根据指定文件个数拆分文件，默认不拆分；
-S，可根据指定行数拆分文件，默认不拆分；
reads接头序列裁剪功能：
-A，若此参数存在，则关闭裁剪测序接头序列功能，默认启用；
-a，接头序列，默认自动检测；
reads全局裁剪功能：
-f，裁剪reads1 5'端该长度的碱基，默认无；
-t，裁剪reads1 3'端该长度的碱基，默认无；
-F，裁剪reads2 5'端该长度的碱基，默认无；
-T，裁剪reads2 3'端该长度的碱基，默认无；
reads polyG裁剪功能：
-g，执行polyG裁剪功能；默认情况下，仅识别Illumina NextSeq/NovaSeq数据执行polyG裁剪；
-G，关闭polyG裁剪功能；默认情况下，仅识别Illumina NextSeq/NovaSeq数据执行polyG裁剪；
reads滑窗裁剪功能：
-5，在reads 5'端启用根据碱基质量值的裁剪，默认无，（该参数启用会影响后续分析中对deduplication数据的识别）；
-3，在reads 3'端启用根据碱基质量值的裁剪，默认无，（该参数启用会影响后续分析中对deduplication数据的识别）；
-W，设定reads裁剪的滑窗大小，默认4碱基为一滑窗；
-M，滑窗中碱基平均质量低于该设定阈值时，将被裁剪，默认阈值为q20；
reads过滤功能（根据碱基质量、N碱基数量、长度等）：
-Q，若此参数存在，则关闭质量筛查功能，默认启用；
-q，设定期望碱基质量值，质量值低于该值的碱基视为不合格，默认值15表示phred quality >= q15合格；
-u，允许reads中存在多少个碱基不合格，取值0-100，默认值40表示40%；
-n，如果一个read中的N碱基大于此设定值，该read将被剔除，默认值为5；
-L，若此参数存在，则关闭长度筛选功能，默认启用；
-l，如果一个read的长度低于此设定值，该read将被剔除，默认值为15；
reads碱基校正功能：
-c，若为双端测序数据（paired-end reads，PE reads），可根据reads重叠区执行碱基校正，默认禁用；
对带分子标签（UMI）的数据处理功能：
-U，启用unique molecular identifer (UMI)程序；
Over-represented序列分析功能：
-p，启用over-represented reads分析；
-P，统计over-represented reads在指定测序扩增循环次数中的基本信息，默认第20轮循环。

举例

使用fastp默认参数质控后fastqc显示的质控报告（read1的）

基本信息

碱基测序质量

碱基分布情况

根据图中显示的问题（第80个碱基往后质量值较低，5'端序列质量值波动）进行参数调整
代码：

fastp -w 7 -f 9 -F 9 -3 -W 1 -M 20 -q 20 -u 40 -l 116 -i control_P_R1.fq.gz -I control_P_R2.fq.gz -o control_P_R1.p.fq -O control_P_R2.p.fq -h p.html

-w 7 线程数为7
reads全局裁剪功能
-f 9 全局裁剪，所有reads1 从5'端剪去9个碱基
-F 9 全局裁剪，所有reads2 从5'端剪去9个碱基

reads滑窗裁剪功能
-3 在reads 3'端启用根据碱基质量值的裁剪
-W 设定reads裁剪的滑窗大小为1，默认4碱基为一滑窗；数值越小，窗口所包含的碱基越容易被切除 非常之关键
-M 20 滑窗中碱基平均质量低于该设定阈值时，将被裁剪，默认阈值为20

reads过滤功能
-q 20 设定期望碱基质量值，质量值低于该值的碱基视为不合格
-u 40 允许reads中存在多少个碱基不合格，取值0-100，默认值40表示40%（若-u 30 一条read允许有30％的碱基不合格（Q值设为20）,超过30％被过滤掉）
-q 20 -u 40 一个read最多只能有40%的碱基的质量值低于Q20，否则会被过滤掉
-l 116 如果一个read的长度低于116，该read将被剔除，默认值为15 （l值得确定是根据全局剪切的参数设置的，如果测序策略为PE125，-f 为5，此时大部分reads长度为116，-l的值此时就设为116，若设为125，则所有reads都被过滤掉了）

ps:滑窗裁剪和接头序列裁剪（-a,默认开启）都是局部裁剪

fastqc形成更清晰的质控报告

fastqc -o ~/WGBS/1_RawData/insulin.fastqc insulin_P_R1.fastp.fq insulin_P_R2.fastp.fq

调整fastp参数质控后的结果

碱基测序质量

碱基分布情况

fastqc和fastp同时执行:

fastp -w 7 -f 9 -F 9 -3 -W 1 -M 20 -q 20 -u 40 -l 116 -i insulin_P_R1.fq.gz -I insulin_P_R2.fq.gz -o insulin_P_R1.fastp.fq -O insulin_P_R2.fastp.fq -h insulin_P.html;fastqc -o ~/WGBS/1_Raw
Data/insulin.fastqc insulin_P_R1.fastp.fq insulin_P_R2.fastp.fq

参考

生信工具Fastp的安装及其在二代测序数据过滤质控中的使用说明
fastp: 极速全能的FASTQ文件自动质控 过滤 校正 预处理软件
RNA-seq从过滤低质量到去接头完整质控步骤