RFect 小核酸转染试剂步骤

操作步骤 :本说明书适用于 24 孔培养板的转染实验,其他规格的培养板的用量参照下面表格,表格给出的是每孔的用量与体积。

A. 细胞接种:转染前一天接种细胞,每孔 500 μl 培养基(不可加抗生素),使细胞在转染时密度在 30-50%。

B. siRNA-RFect 混合物准备:

1. 6pmol siRNA 用 50μl 无血清培养基稀释。

2. 2μl RFect 用 50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀,室温孵育 5min。 注意:确保在 25 min 内执行第三步操作,不要过于延迟。

3. 孵育 5min 后,将 siRNA 稀释液与 RFect 稀释液混合(总体积 100μl)。轻轻混匀,室温孵育 20 min。

C. 将混合物加到培养的细胞内(完全培养基培养):

1. 将 100μl 混合物加入培养孔内,培养孔内含有 0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板,混匀。

2. 37°C 培养 18-72h,检测基因抑制效果。如果需要,细胞培养 4-6h 时可以更换培养基,但不是必须。孵育时间的长短,取决于细胞类型、

所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

转染实验要点:

 转染过程不可添加抗生素,否则会导致细胞死亡;

 首次实验 siRNA 的用量设置在终浓度 10nM、30nM、50nM、100 nM 进行摸索 ,后续实验根据实验结果修改。

转染实验优化: 为了提高转染效率, 最好 对转染条件进行优化 ,特别是首次使用 。 例 如 :24 孔培养板 ,整 调整 siRNA 与 与 RFect 试剂的用量 。

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