一、外源 DNA 片段成功插到载体里面（PCR 鉴定），但无法表达蛋白
一般判断目的基因是否表达，首先要进行 SDS-PAGE 检测。跑胶的时候一定要设对照：Marker，标准品阳性对照，以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2 个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。跑 SDS-PAGE 的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在 100ng 左右；但是不能跟着做 western blot 了。银染的灵敏度在 0.1～1 ng；或是 Sypro Red，灵敏度高还可以继续做 Western blot。在做过 Western Blot 仍没有检测到表达带，那么就要先判断载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。其次要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。最后，也需要注意基因中是否有稀有密码子，可更换表达菌株。每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。不同的载体要配合一定的菌株使用，像 pET 系列就一定需要有 T7 RNA 聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。例如，使用 BL21（DE3）菌株表达不成功可以尝试用 Rosetta 系列菌株表达，它能够由一种氯霉素抗性的、与 pET 相容的质粒提供 AUA，AGG，AGA，CUA，CCC 和 GGA 的 tRNA。所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。没有发现原则性错误之后，可以从表达条件入手，梯度条件改变表达温度、IPTG 浓度，低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达；低浓度的 IPTG 可以减少化学物质对细胞的损伤。而且培养基中的葡萄糖可能会抑制表达。导致表达的蛋白与预期的不同。如果尝试改变条件后依然没有表达，可以试试换不同的培养基（如 LB、TB、M9 等）。如果以上方法均无法表达出目的蛋白，可更换载体-表达系统。在换过不同载体，不同菌株之后仍是表达不出来的话，可以尝试其它的表达系统，因为有些蛋白是在大肠杆菌表达系统中无法表达。
二、蛋白表达出来了，但是跑 SDS-PAGE 时大小不符?
SDS-PAGE 时蛋白的净电荷会影响迁移率。带电量高的蛋白会结合较少的 SDS，阻碍蛋白的泳动。富含脯氨酸的蛋白会在 SDS-PAGE 胶中移动得特别慢。 如果蛋白的等电点在 5~9 之间， 并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的，可能是稀有密码子造成表达产物的截短。利用 C 端或者 N 端的标签进行 Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而导致多条目的条带或者比预期小很多的条带出现。
三、重组表达的蛋白为不可溶包涵体
大多数在大肠杆菌中表达的外源蛋白都是以包涵体形式存在。一般情况下，形成包涵体表达产率都很高，并且容易分离，得到比较纯的包含体。包涵体致密的结构有助于防止蛋白酶对它的降解作用，如果毒性较强的蛋白形成包涵体也就不会对细胞产生太大的损伤。 如果表达蛋白的目的是为了作为抗原制备抗体， 那么可以用 PBS 将包涵体悬浮，使用佐剂将溶液乳化后注射进入动物体内进行免疫。包含体的形成据分析原因之一在于表达量过高， 表达产物来不及折叠为活性形式——多数以高表达见长的表达系统都会得到包含体产物。如果融合表达含有标签，常用的做法是将包涵体用尿素溶解后在变性的情况下进行纯化，然后复性。
柱上复性方式： 蛋白在变性状态下上柱后，使用一定浓度的尿素或盐酸胍、1mM还原型及0.2mM氧化型谷胱甘肽淋洗，随后用咪唑洗脱。
透析/稀释复性：在透析去除尿素的过程中加入还原型及氧化型谷胱甘肽 或者CHAPs等表面活性剂可以有助于蛋白的正确折叠。
四、如何获取可溶性蛋白
如果需要获得具有一定活性的表达蛋白， 那么最好让蛋白可溶形式表达， 避免包涵体形成。 避免包涵体的方法很多，比如：选用表达量不高的表达系统，选择有助于可溶性表达的融合表达系统比如 pThio，pMal 等等，对于 T7 系统来说降低或者减少诱导条件（例如降低 ITPG 浓度减少 T7 聚合酶）从而降低表达速度，使用基本培养基等也有助于可溶性表达。另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，同样容易导致表达产物不溶，更换菌株例如 Novagen 的 Origami 系列也有助于解决这个问题。还有一种方法是当蛋白挂在柱子上的时候，在还原和氧化的谷胱甘肽存在的情况下用浓度从 6M 到 0M 的盐酸胍过柱，促使蛋白的折叠。在蛋白重新折叠后用咪唑洗脱。德泰的上清蛋白表达服务通过条件矩阵正交优化的方法，使重组蛋白表达在上清液中，即获得具有相当活性的表达蛋白。
五、切除标签时引入的蛋白酶是否一定要切除?
很多时候我们要用蛋白酶除去加入的标签，在蛋白酶切除标签后是否一定要去除呢?有人认为蛋白酶与目的蛋白加入的比例是 1:500 甚至更低，蛋白酶是不会影响到下一步操作的，在一些粗放的生化实验不用去处蛋白酶。严谨的后继实验需要将蛋白酶除去。很多公司已经开发出带有标签的蛋白酶，使得仅通过过亲和柱就可以方便的去除蛋白酶和融合标签。Tag-Free 技术与传统的标签切除技术不同，不存在蛋白酶引入导致杂蛋白影响的情况，具体对比
如下：
六：如何提高蛋白的可溶性表达比例及表达量？
有些蛋白质表达水平低，或者表达的大多是包涵体，通常情况下通过基因优化，载体及菌株的筛选，表达条件优化，诱导条件优化等可以有效增加蛋白的可溶性比率及表达量。
1. 密码子优化密码子优化是根据大肠对密码子的偏好性进行优化筛选，一般选择使用频率大于20%的密码子。经过优化的基因序列能提高mRNA二级结构的稳定性，避免因为不充足的tRNA库导致翻译延迟，成熟前翻译终止，翻译移码和氨基酸错配。
2. 降低蛋白表达速率通过降低IPTG的诱导浓度，降低蛋白的表达速率。通过调节促使肽链聚集的速率与其折叠速率平衡，有利于提高蛋白的可溶性表达。
3. 温度
37℃的表达条件往往会使一些蛋白形成包涵体，而30度的表达条件则可能产生可溶的或者有活性的蛋白。在某些条件下（12-20度）延长诱导时间（过夜）会使溶解性蛋白的产量达到最大，常见16、18、21℃。
4. 细胞周质表达我们可以选用一些将蛋白运输到细胞周质的载体。周质空间更有利于蛋白的正确折叠及二硫键的形成。常规选用的载体有pet22系列。但是我们要注意的是，有些蛋白并不适合于被运输到周质空间，比如一些与β-gal融合的周质的内部被证明是有毒的。
常见原核表达载体：
pET28a简介
载体描述
pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。
T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下终止蛋白翻译。
载体序列
LOCUS Exported 5369 bp ds-DNA circular SYN 14-MAR-2019
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS .
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 5369)
AUTHORS zpyao
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Thursday, Mar 14, 2019 from SnapGene Viewer 4.3.4
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..5369
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
rep_origin 12..467
/direction=RIGHT
/label=f1 ori
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
CDS complement(560..1375)
/codon_start=1
/product="aminoglycoside phosphotransferase"
/label=KanR
/note="confers resistance to kanamycin in bacteria or G418
(Geneticin(R)) in eukaryotes"
/translation="MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYG
KPDAPELFLKHGKGSVANDVTDEMVRLNWLTEFMPLPTIKHFIRTPDDAWLLTTAIPGK
TAFQVLEEYPDSGENIVDALAVFLRRLHSIPVCNCPFNSDRVFRLAQAQSRMNNGLVDA
SDFDDERNGWPVEQVWKEMHKLLPFSPDSVVTHGDFSLDNLIFDEGKLIGCIDVGRVGI
ADRYQDLAILWNCLGEFSPSLQKRLFQKYGIDNPDMNKLQFHLMLDEFF"
rep_origin 1497..2085
/direction=RIGHT
/label=ori
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
misc_feature 2271..2413
/label=bom
/note="basis of mobility region from pBR322"
CDS complement(2515..2706)
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein, which maintains plasmids at low copy
number"
/label=rop
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
CDS complement(3515..4597)
/codon_start=1
/gene="lacI"
/product="lac repressor"
/label=lacI
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/translation="MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
YIPPLTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPR
ALADSLMQLARQVSRLESGQ"
promoter complement(4598..4675)
/gene="lacI"
/label=lacI promoter
primer_bind 4984..5003
/label=T7 promoter primer
promoter 4984..5002
/label=T7 promoter
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
protein_bind 5003..5027
/label=lac operator
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
misc_feature 5058..5063
/label=RBS
CDS 5083..5100
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/label=6xHis
/translation="HHHHHH"
CDS 5110..5127
/codon_start=1
/product="thrombin recognition and cleavage site"
/label=thrombin site
/translation="LVPRGS"
CDS 5131..5163
/codon_start=1
/product="leader peptide from bacteriophage T7 gene 10"
/label=T7 tag (gene 10 leader)
/note="promotes efficient translation in E. coli"
/translation="MASMTGGQQMG"
misc_feature 5167..5212
/label=MCS
CDS 5213..5230
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/label=6xHis
/translation="HHHHHH"
primer_bind complement(5283..5301)
/label=T7 ter primier
terminator 5297..5344
/label=T7 terminator
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
ORIGIN
1 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg
61 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc
121 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg
181 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc
241 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt
301 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc
361 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta
421 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt
481 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta
541 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat
601 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa
661 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc
721 gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga
781 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc
841 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac
901 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac
961 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat
1021 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag
1081 tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca
1141 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac
1201 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg
1261 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca
1321 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac
1381 cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa
1441 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga
1501 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg
1561 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc
1621 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag
1681 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc
1741 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg
1801 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac
1861 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga
1921 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt
1981 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag
2041 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg
2101 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta
2161 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc
2221 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg
2281 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta
2341 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg
2401 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct
2461 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag
2521 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc
2581 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag
2641 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt
2701 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa
2761 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg
2821 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg
2881 tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc
2941 tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta
3001 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca
3061 gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc
3121 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc
3181 catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa
3241 ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc
3301 gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac
3361 gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca
3421 ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta
3481 atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa
3541 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat
3601 tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca
3661 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa
3721 aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt
3781 atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg
3841 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca
3901 gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta
3961 tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg
4021 agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat
4081 gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct
4141 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg
4201 catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat
4261 tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc
4321 tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca
4381 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg
4441 ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt
4501 tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg
4561 catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct
4621 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga
4681 tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg
4741 ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc
4801 ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg
4861 cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg
4921 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga
4981 aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa
5041 ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac
5101 agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg
5161 ggtcgcggat ccgaattcga gctccgtcga caagcttgcg gccgcactcg agcaccacca
5221 ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc
5281 caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt
5341 tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat
//
别名:pet28a, pet 28a, pET-28a(+)
载体类型：大肠杆菌蛋白表达质粒
载体抗性：Kanamycin 卡那霉素
载体标签：N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His
表达水平:高拷贝
载体大小:5369 bp
启动子：T7/lac
克隆方法:多克隆位点，限制性内切酶
5' 测序引物:T7：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
3' 测序引物：T7 ter: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
备注可用镍柱来纯化带组氨酸的融合蛋白。N端含有Thrombin蛋白酶切位点; pET28a, b, c的差异仅仅存在于多克隆位点处。