Integrated multi-omics analyses reveal that BCAM is associated with epigenetic modification and tumor microenvironment subtypes of clear cell renal cell carcinoma
综合多组学分析显示，BCAM与透明细胞肾细胞癌的表观遗传修饰和肿瘤微环境亚型有关
发表期刊：Clin Epigenetics
发表日期：2022 Aug 8
影响因子：7.259
DOI: 10.1186/s13148-022-01319-2
一、背景
肾细胞癌（RCC）是最常见的肾癌形式，占85%的病例。根据其不同的形态和特定的驱动基因改变，RCC已被细分为至少12种亚型。其中，透明细胞RCC（ccRCC）、乳头状RCC（pRCC）和嫌色RCC（chRCC）是三个主要亚型，占RCC的90%以上。
基底细胞粘附分子（BCAM）是一种90 kDa的膜结合糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族（IgSF），作为细胞外基质蛋白层粘连蛋白的受体发挥作用。越来越多的证据表明，BCAM与不同的癌症有关。
很少有研究关注BCAM在肿瘤中异常表达的调控机制，只有一个报道称BCAM在胃癌中的表达受到lncRNA BAN的调控。表观遗传学包括特定的可遗传的DNA和染色质特征，对特定细胞系中正确转录程序的建立和维持有重要影响，在其特征中，组蛋白的翻译后修饰和DNA/RNA甲基化是最重要的。
二、材料与方法
1、数据来源
1）TCGA：肾脏透明细胞癌（ccRCC）的533个肿瘤组织样本和72个相邻的正常组织样本；肾脏乳头状细胞癌（pRCC）的290个肿瘤组织样本和32个相邻的正常组织样本；肾脏嫌色细胞癌（chRCC）的66个肿瘤组织样本和25个相邻的正常组织样本
2）6个外部数据集，有311例入选，包括Higgins Renal（n = 44），Gumz Renal（n = 20），Beroukhim Renal（n = 70），Yusenko Renal（n = 67），Lenburg Renal（n = 18）和Jones Renal（n = 92）
3）从GEO数据库中下载了3个芯片数据集：GSE53757、GSE40435和GSE66272，均包含不少于20个人类ccRCC和邻近正常组织
4）健康人类肾脏组织的单细胞转录组分析数据来自GSE131685，总共有25279个来自三个人类捐赠者的肾脏的细胞被纳入分析
5）组织样本：12例肿瘤组织样本和3例正常组织样本
2、分析流程
1）RNA表达分析：基于TCGA评估了BCAM基因在各种癌症的肿瘤组织和邻近正常组织中的表达水平，并通过TIMER显示结果；利用Oncomine平台，分别对BCAM基因在ccRCC、pRCC、chRCC和对照样本中的表达差异进行了t检验；单细胞分析
2）蛋白质表达分析：通过HPA对12例肿瘤组织样本和3例正常组织样本的免疫组化结果验证了BCAM在蛋白水平的表达；Western blot，进一步研究患者群中RCC组织和邻近正常组织之间BCAM蛋白表达的差异；利用CPTAC的数据，用UALCAN工具进一步验证BCAM在肿瘤和正常组织中的蛋白组表达差异，并计算出BCAM在ccRCC蛋白水平上低于正常肾组织BCAM表达中位数的比例；进一步应用一种基于蛋白质组的分类方法，对代表六种组织类型（乳腺、结肠、卵巢、肾脏和子宫）的532种癌症进行质谱分析，对CPTAC数据库中的ccRCC进行分类
3）基因改变分析：探讨了基于TCGA队列的ccRCC基因突变数据中BCAM基因的改变频率；选择了整个ccRCC队列中改变频率最高的基因，比较这些基因的改变频率在BCAM-低和BCAM-高亚组中是否存在差异；使用Spearman排名分析描述了BCAM基因表达与TMB/MSI的相关性；建立MEXPRESS图来研究CNV与BCAM表达水平和BCAM基因的CNV类型之间的相关性
4）表观遗传学修饰分析：探讨了BCAM基因与几个参与DNA甲基化的基因之间的相关性；重点研究了甲基化程度较高的探针，包括cg03074126、cg14037553、cg17489534、cg24122751、cg22640961、cg12249345、cg21978694、cg05670193和cg23318764，并研究了这些探针在ccRCC的肿瘤和正常组织之间甲基化程度的差异；分析了BAP1突变状态和BCAM甲基化水平之间的相关性
5）潜在的治疗策略分析：IC50评估BCAM低组和BCAM高组的治疗反应；用TIDE算法预测BCAM-低和BCAM-高亚组的潜在免疫检查点阻断反应
6）临床病理和预后分析：分析BCAM mRNA表达与ccRCC、pRCC和chRCC各种临床特征之间的关系，包括年龄、性别、pT期、pN期、转移状态、肿瘤分级等
7）功能和通路富集分析：使用 "Limma "软件包分析了BCAM-低和BCAM-高亚组之间mRNAs的差异表达；进行GO和KEGG途径富集分析
8）免疫浸润和免疫检查点分析：使用 "immunedeconv "软件包观察BCAM-低和BCAM-高亚组之间的免疫细胞分数分布差异；计算并展示了ccRCC微环境中各种免疫细胞的比例
三、实验结果
01 - BCAM在RCC中的表达异常下调
从TCGA中评估了BCAM在肿瘤和正常组织中的RNA水平的差异表达（图1A），与相应的正常组织的中位表达水平相比，BCAM在所有三种典型的RCC亚型中的表达明显下降。BCAM在RCC中的低表达在其他六个外部数据集中得到了依次验证（图1B）。此外，它在ccRCC肿瘤样本中的表达情况在GSE53757（n = 72）、GSE40435（n = 101）和GSE66272（n = 26）数据集中得到了进一步验证（图1c）。上述结果证实，在所有三种亚型的RCC中，BCAM在mRNA水平的表达都低于正常组织。
然后，利用HPA数据库中的石蜡包埋样本，研究BCAM在RCC和邻近正常组织中的蛋白水平的表达模式。首先，免疫组化染色显示，对于12个ccRCC肿瘤组织和3个正常肾组织中的BCAM蛋白，BCAM蛋白在三个正常组织中都可以检测到，强度适中，在肾小管的膜和细胞质中数量占75-25%，但在ccRCC肿瘤组织中几乎（12个中的11个）无法检测到（图1D）。利用GSE131685的人类肾脏scRNA-seq数据，将肾脏组织中总共25279个细胞分为14个集群，包括近端肾小管细胞（c-0、c-1、c-2、c-3、c-4、c-5、c-6、c-8、c-10），远端肾小管细胞（c-11），集合管细胞（c-12），T细胞（c-7）和巨噬细胞（c-8），B细胞（c-13）。收集管细胞的标志物是AQP2、CLDN8、PVALB和TMEM213；远端小管细胞的标志物是SLC12A1、TMEM72和UMOD；近端小管细胞的标志物是MIOX、SLC22A8和TMEM174。发现BCAM mRNA主要在上皮细胞群中表达（图1E）。BCAM mRNA的表达水平在集合管细胞c-12中最高，其次是近端肾小管细胞c-8和c-5，这与IHC染色显示BCAM蛋白主要分布在正常组织的肾小管的结果一致。随后，对本中心的冷冻样本进行了Western blotting检测。归一化结果与之前的结果一致，表明BCAM蛋白在ccRCC中的下调（图1F）。最后，利用CPTAC数据库再次确认BCAM在ccRCC中肿瘤和正常组织在蛋白水平上的表达差异（图1G），共包括110个原发性肿瘤组织样本和84个正常组织样本作为阴性对照。结果显示，90.91%的ccRCC组织的BCAM蛋白表达较低（低于正常肾组织BCAM表达水平的中位数），ccRCC和正常组织之间BCAM蛋白水平的差异有统计学意义。BCAM在蛋白水平的表达与RNA水平的表达一致，揭示了BCAM在肾脏肿瘤组织中的表达确实在mRNA和蛋白水平都有下调。
02 - BCAM的低表达与不良的临床病理参数和预后较差有关
作者研究了BCAM失调在RCC中的潜在功能作用，收集并分析了临床病理参数。首先，探讨了整个RCC队列中BCAM mRNA表达与临床病理特征之间的关系。结果显示，BCAM mRNA表达与年龄、pT期、转移状态和肿瘤分级呈负相关。进一步分析了BCAM在mRNA水平的表达与临床病理参数的关系，并按RCC组织学类型进行分层。对于ccRCC，BCAM的表达与pT阶段、转移状态和肿瘤等级再次呈反比（图2A-D）。对于pRCC和chRCC，除了pN阶段，BCAM和临床病理变量之间没有关系（图S1A-E）。最后，还分析了TCGA数据库中BCAM mRNA表达与总生存期（OS）的关系，结果表明，ccRCC中BCAM的低表达与OS呈负相关，而在pRCC和chRCC中，BCAM的表达并不影响生存状态（图2G）。
之后，分析了CPTAC数据库的数据，发现BCAM在蛋白水平的表达与肿瘤分级的关系与mRNA水平的表达一致（图2E）。此外，根据基于质谱的蛋白质组学分类（K1-K10），数据库中收录的194例ccRCC可以被细分为8个亚组（K4和K6除外），每个亚组都有显著的特点。总的来说，不同蛋白组亚型的BCAM表达水平明显低于相邻的正常组织，并注意到那些属于K2亚型（与适应性免疫反应和T细胞激活有关）的BCAM表达水平最低，表明BCAM下调与免疫相关信号的激活之间存在潜在联系（图2）。
03 - BCAM在ccRCC中失调的潜在机制
由于BCAM的表达与各种临床特征相关，并预测ccRCC的预后，将ccRCC样本分为BCAM低和BCAM高的亚组可能具有临床意义。将BCAM的中位表达量设定为分界值，并进一步寻找BCAM高和BCAM低的亚组之间的多组学差异。为了找出BCAM基因在ccRCC中的潜在调控机制，根据TCGA队列中ccRCC数据中BCAM的差异性表达，初步检测了DNA改变和拷贝数变异（CNV）状态。BCAM本身的体细胞突变频率极低（0.3%），并不能解释其在ccRCC中低表达的高比例（图S1F）。如图3A所示，BAP1突变的频率高得多，是唯一与BCAM低表达有关的改变，预示着预后不佳。在BCAM低表达亚组中，有BAP1突变的患者比没有BAP1突变的患者的OS更差（图S1G）。
作者还分析了BCAM基因表达与TMB、MSI之间的相关性。在ccRCC中，BCAM的低表达与较高的TMB相关（图3B）。同时，BCAM和MSI状态之间没有关系。最后，调查了CNV与BCAM表达的关系，发现没有相关性（图 3C）。总之，这些结果表明，基因改变不能解释BCAM的失调；相反，BCAM的低表达可能与ccRCC中BAP1突变的高频率有关。
接下来，利用TCGA数据库探讨了BCAM在ccRCC中的下调是否受表观遗传学修饰的调节。首先考虑了DNA甲基化修饰，并展示了BCAM基因和涉及DNA甲基化的几个基因之间的相关性（图3D）。结果显示，BCAM基因与ccRCC中大多数甲基化相关酶的表达呈正相关，如MECP2、MBD3和TET2。然后，根据TCGA项目中450 k DNA甲基化芯片的测序结果，生成一个瀑布图，将甲基化水平与基因亚区直观地联系起来（图4A）。几个与BCAM相关的探针有很高的甲基化程度，包括cg03074126、cg14037553、cg17489534、cg24122751、cg22640961、cg12249345、cg21978694、cg05670193和cg23318764。作者进一步深入研究了这些探针的甲基化水平与ccRCC中BCAM表达之间的具体相关性。结果发现，在333个ccRCC样本中，9个探针中的8个探针的甲基化水平与BCAM基因表达呈负相关，其中CpG岛相关探针cg22640961显示出最强的负相关，其次是cg12249345，cg21978694，cg24122751，cg14037553，cg17489534，cg23318764和cg05670193。然而，cg03074126是个例外，其甲基化水平与BCAM的表达强烈正相关。同时，当整合CpG岛相关探针的结果时，表明BCAM的低表达可能是由于其CpG岛相关的甲基化修饰。此外，研究这些探针的甲基化程度在肿瘤和正常组织之间是否有差异，发现除cg03074126和cg05670193外，所有探针的甲基化程度在ccRCC的肿瘤组织中都明显高于正常组织（图4B）。
鉴于上述分析结果表明，在ccRCC中BCAM的低表达与BAP1突变的高频率并存，进一步尝试探讨BAP1突变状态与BCAM甲基化水平之间的关系。BCAM的三个探针，包括cg06522456，cg08319238和cg14037553，与BAP1野生型ccRCC相比，在有BAP1突变的ccRCC中显示更高的甲基化水平，表明BAP1突变调节BCAM表达水平的潜在机制（图S1H）。总的来说，这些结果表明，BCAM相关的表观遗传学修饰与其基因调控和RCC患者的预后明显相关。
04 - BCAM的不同表达表示不同的转录组特征
作者试图进一步探讨BCAM低组和BCAM高组的转录组差异，并分别为潜在的治疗方案找到线索。因此，首先观察了基于TCGA数据库的BCAM-低组和BCAM-高组之间的差异表达基因（图4C）。结果表明，与BCAM-high亚组相比，BCAM-low亚组有145个向上表达的基因和539个向下表达的基因。
KEGG通路（Up）富集分析和GO（Up）富集分析都表明，BCAM低亚组中上表达的基因大多富集于免疫相关的信号通路，包括 "细胞因子-细胞因子受体相互作用"、"趋化因子信号通路"、"细胞黏附分子"和 "抗原处理和表达"（图4D）。为了进一步研究ccRCC的免疫状态，比较了BCAM低和BCAM高的亚组之间的免疫浸润，发现在ccRCC样本中，大多数免疫细胞类型在BCAM-低亚组中有所增加（图5A）。还计算了ccRCC的肿瘤微环境（TME）中这些免疫细胞亚群的组成（图5B）。CPTAC数据库的数据进一步显示，与代谢性免疫沙漠、VEGF免疫沙漠和CD8-炎症亚群相比，CD8+炎症亚群的BCAM mRNA和蛋白表达水平最低，而BCAM甲基化水平最高，与上述结果一致（图5D）。此外，VEGF免疫沙漠亚组在4个免疫亚组中具有最高的BCAM mRNA和蛋白质表达水平和最低的BCAM甲基化水平。
还利用TCGA数据库评估了BCAM低和BCAM高亚组的8个免疫检查点的表达，看其在ccRCC中是否存在表达水平的差异（图5C）。结果发现，与BCAM高的亚组相比，BCAM低的亚组中CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2和TIGIT的表达有不同程度的升高。进一步分析发现，与BCAM高的亚组相比，这7个免疫检查点在BCAM低的亚组中的甲基化水平都较低（图S2A）。这些结果表明，免疫检查点可能导致ccRCC中肿瘤细胞的免疫逃逸。
另一方面，对BCAM高分组的KEGG和GO富集分析显示，血管生成相关途径明显富集（图4D）。进一步确认BCAM高亚组的ccRCC样本中，血管生成的激活程度是否更高。比较了BCAM-低亚组和BCAM-高亚组的36个相关基因的表达水平，结果表明16个血管生成相关基因，包括JAG2、JAG1、MSX1、SLCO2A1、APP、PDGFA、PTK2、VEGFA、NRP1、STC1、FGFR1、LPL、KCNJ8、LRPAP1、CCND2和THBD，在BCAM-高亚组显著上调（图5E），而在BCAM低的亚组中只有四个被上调。还发现对于JAG1、MSX1、SLCO2A1、APP、PTK2、NRP1、STC1、FGFR1、KCNJ8、LRPAP1、CCND2和THBD，BCAM高分组的甲基化程度低于BCAM低分组（图S2B）。所有的研究结果显示，在BCAM高的ccRCC患者中，有更多的血管生成相关的基因上调被富集。
05 - 基于ccRCC中不同BCAM表达模式的潜在治疗策略
最后，研究了BCAM在ccRCC治疗中的预测价值。根据GSDC数据库计算了酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物的敏感性，在不同的BCAM表达亚组内进行比较。结果显示，在BCAM高的亚组中，索拉非尼、帕唑帕尼和阿西替尼的半最大抑制浓度（IC50）明显低于BCAM低的组别（图5F）。这些结果表明，对于BCAM高表达的ccRCC患者应考虑抗血管生成治疗。
TIDE算法通过结合T细胞功能紊乱和排斥特征对肿瘤的免疫逃避进行建模，TIDE预测得分越高，免疫检查点抑制剂（ICI）反应越差。利用TCGA数据库，计算并比较了BCAM-低和BCAM-高亚组的TIDE得分。与BCAM-高亚组相比，BCAM-低亚组的TIDE评分要低得多（图5G），表明BCAM-低亚组可能对基于ICI的免疫疗法反应更好。考虑到多个不同的免疫检查点的上调，包括CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2和TIGIT，双重或三重ICI联合治疗可能在BCAM低表达的ccRCC中是有希望的。
四、结论
本研究揭示了BCAM在RCC中的表达情况，并发现BCAM的下调与ccRCC的预后较差明显相关。DNA甲基化修饰可能是导致BCAM失调的主要原因之一。以高免疫浸润和免疫检查点表达为特征的BCAM低亚组可能决定了对基于ICI的免疫疗法更有利的反应。同时，抗血管生成疗法可能更适用于以血管生成丰富为特征的BCAM-高亚组。本研究数据表明，BCAM的表达可以预测ccRCC的预后，并可以根据不同的分子特征对ccRCC的潜在治疗策略提出建议。