增加生理盐水的检测,防止样品处理的较差污染,特别是拔牙处理过程中;对实验室质检。
检测结果出现“假阳性”:首先排除实验室污染导致假阳性,污染来源主要来自扩增产物的污染(气溶胶污染)、检测样本间的交叉污染(加样过程、提取过程)、检测试剂的污染(容易验证)、检测仪器的污染等。目前实验室大规模气溶胶污染存在很少,但是部分实验室存在轻微的气溶胶污染。实验室污染监测可通过试剂盒阴性对照(仍有部分实验室扩增反应不添加阴阳性对照)、扩增试剂对照、提取中空白对照、提取中带入的空反应管重复性试验以及选择不同区域的引物扩增(其他靶标)。检测试剂盒中引物、探针等原料品质不过关,质量控制不严格,非特异性扩增(出现比例较高,并且CT值基本相近,差异不大)、干扰物影响等也可能导致试剂盒假阳性。
为进一步协助规模猪场提高其检测诊断水平,定期的以第三方的视角去监测猪场现有检测体系中的不足,并针对性的提出解决方案,跟踪执行,持续地建立和完善生物安全措施和流程,从而达到防止传染性疾病传入的目的。
一、日常监测方案
1、猪场外监测点
入场公路、实体围墙周围、洗消点、入场车辆、返场人员、进场的物资、有害生物、无害化处理点、沼气池、周边猪场外围等;
2、生活区监测点
厨房、员工宿舍、食堂、洗衣房、物资进出通道、人员进出通道、隔离房、公共活动区、仓库、围墙边等;
3、生产区监测点
药房、洗浴房、洗衣房、电工房、换鞋处、进出通道、外水帘、风机内外侧、生产区食堂、休息室、场长办公室等;
4、猪舍内监测点
进门换鞋处、粪沟内、走道、栏舍内、风机水帘、料盒顶等
二、监测项目
1、健康猪群每周按照上诉采样方案监测非洲猪瘟核酸;
2、每月定期按照每单位选择靠门处的5-10头猪抽检非洲猪瘟抗体(间接ELISA方法);
3、异常猪只监测:死亡、流产、发烧、身体发红、采食异常等,采样(口鼻拭子、尾根血拭子、母猪脐带血、腹股沟淋巴结),一头异常猪采集多个样品进行合样检测非洲猪瘟病毒核酸+非洲猪瘟抗体(单个猪只可选用-抗体胶体金)
4、一旦出现阳性样品,及时选择鉴别试剂盒检测P72/MGF/CD2V,P72/EGFP(mCherry),P72+I177L等进行鉴别诊断,对于鉴别是野毒但临床症状不明显,可选择全基因组或者二代测序等进行毒株鉴别(具体可咨询本司服务人员);
5、核酸检测异常结果处理
对于荧光PCR检测结果CT判定:
当CT值<38,复测结果稳定保持在38以内,即可确认样品为阳性;
当CT值>38,复测结果不稳定,需要设置至少3个平行样本,一个阳性即判断阳性;建议重新采集样品,若为猪只样品,应首先隔离猪只,增加猪血样、口鼻液、淋巴穿刺(三样合一)通过不同组合提高检出率;同时选择非洲猪瘟抗体检测试剂条进行加测抗体。
三、常规采样注意事项及细节
釆样对象包括猪只、人员、环境、车辆,采样所需材料和方法如下:
1、釆样准备工作
加厚自封袋(不建议使用离心管采样,不方便实验室人员处理样品,自封袋有利于对样品棉签头进行揉捏处理更好释放病毒)、生理盐水(环境样品核酸保护液)、50cm植绒拭子、纱布、针头、标签纸笔、一次性EP手套、乳胶手套、接产用长臂手套、鞋套及防护服、护目镜。
向干净的自封袋中加入0.8-1.0毫升的生理盐水(样品保护液),贴上标签;采样前人员需穿好防护服,戴好乳胶手套+一次性手套(猪只采样+接产手套防止污染采样人员)和鞋套。
2、采样方法
2.1 口鼻腔拭子釆样:
取出干净的植绒拭子(20cm),将其插入猪只鼻腔内1〜2厘米,沿鼻腔内壁擦拭一圈,另取植绒拭子(50cm),插入猪只嘴巴中反复摩擦,取到粘稠的口腔液;将取过样的棉签浸入自封袋中,折断多余的杆t,密封;标记好猪只栏位号;
注意事项:
Ø对于鼻腔干燥的猪只可以先用棉签蘸取生理盐水后再在猪只鼻腔内旋转取样;
Ø釆样过程中,如遇个别猪无法采集鼻腔液,可釆集该栏位的环境样品,釆样人员不可进入猪栏内;
Ø釆集下一份样品前,需换上新的一次性手套。
2.2 尾根血拭子釆样:
左手握住猪只尾巴根部,向后上方提起,用一次性针头扎猪只尾尖,然后用左手从尾根到尾尖用力挤压,出血后用干棉签按压出血处,蘸取血液同时止血;将棉签浸入自封袋中,折断多余的棉签杆,密封;标记好猪只栏位号。
2.3 人员釆样
用纱布和棉签蘸取生理盐水后,从上往下依次采集样品,头发、鼻孔、袖口、指尖指甲缝、裤腿、鞋面、鞋底等;将纱布浸入自封袋中,折断多余的棉签杆,密封;记录人员姓名。
2.4 车辆釆样
用纱布和棉签蘸取生理盐水后,采集门把手、方向盘、脚垫、踏板、坐垫、轮胎、底盘、车厢栏杆缝隙等位置;将棉签浸入自封袋中,折断多余的棉签杆,密封;标记好车牌号。
2.5 环境釆样
将干净的湿润纱布,采集区域以5cm*5cm大小为宜;擦拭后放入自封袋中,记录好位置;
釆集水样可将纱布折叠后绑在水龙头出水口,缓慢放水2-3小时后取出纱布。取完样品后将棉签浸入自封袋中,然后记录好釆样编号及对应釆样地点。
四、精准剔除期间采样注意事项
1、普检操作前对料槽走道用喷雾器使用过硫酸氢钾1:100喷淋消毒,需湿润保持半小时。采样时间较长的需每采一排猪进行喷淋消毒,消毒有效期为2小时。
2、注意清水开关选择,选择安全区域,且不经过阳性栏位前后。使用后立即对开关、所接触的区域做消毒。采样按每半排更换防护服鞋套、每料槽隔断更换长
臂PE手套,每头猪更换一次性PE手套。
3、异常猪(减料、皮肤发红、坡脚、眼睛发红等)需每天采咽拭子直至恢复正常,仍未异常的猪只连续三天检测的阴性猪只也做淘汰处理。
4、所有采样以人员不接触猪及栏架为标准要求,极个别咽拭子采集不到才改为采口腔液、料槽内侧及猪只经常舔到的栏杆,并做好标记。近期暂停采集前腔静脉血和尾根血。