链特异性测序的理解 小RNA链特异性

1、链特异性测序的目的
现在二代测序主要有PE和SE两种策略，PE主要用于RNA-seq，SE主要用于小RNA测序（短片段文库测序）。
PE测序，我们可以得到read1和read2；SE测序，我们只有read1。
链特异性测序的目的就是保证绝大多数的read1都和基因方向相同（或相反）。

2、read1\read2怎么来的

read1 & read2

测序仪读取序列的时候是由先后顺序的，因为P7接头首先和flowcell结合。
于是先按read1 primer的方向读取read1，再按read2 primer的方向读取read2。
如果保证每个插入片段，都按同样的方向加上接头（比如5‘加P5接头，3’加P7接头），那么，测序的时候就会先测插入片段的5'端，再测插入片段的3‘端，插入片段的方向就可以确定了。

3、RNA-seq如何实现链特异性

普通RNA-seq

普通的RNA-seq，一段原始的RNA序列，完成cDNA的合成后，我们无法得知哪一条链是原始的了，再加上Y型接头，进行PCR扩增后，有的原始片段可能5‘连接的是P5，有的可能连的P7，所以最后测到的序列一半和原始序列的方向相同一半相反，无法得知序列来自DNA的那一条链。

dUTP-链特异性RNA-seq

利用dUTP掺入的方法，在加Y型接头之后，可以把第二链消化，留下反转录得到的第一条链，于是，第一链的5’端总和P5(P7)相连，可以得知测序得到序列的方向。

4、小RNA测序应该也是链特异性的

NEB小RNA文库

如图构建NEB的小RNA文库，小RNA的5’端可以保证和P5相连，3‘端可以保证和P7相连，所以read1就代表小RNA在基因组上的方向，是链特异性的。