2021-10-10

Cell Rep Met | 基因筛查的通用工具箱STAMPScreen

原创 图灵基因 图灵基因 今天

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基因工程领域积累了一个巨大的工具箱：海量在线数据集、基因编辑工具和快速廉价的基因组测序。根据哈佛Wyss生物启发工程研究所、哈佛医学院 (HMS) 和麻省理工学院媒体实验室的一组科学家和工程师的说法，拼图的缺失部分是一个清晰的路线图，可以帮助研究人员找出目标基因，使用哪些工具，以及如何解释其结果。

为此，该团队创建了一条综合管道，用于进行基因筛查研究，涵盖了从确定感兴趣的目标基因到快速高效克隆和筛查的每一个步骤。

该协议称为基于测序的目标确定和模块化扰动筛选（STAMPScreen），发表在《Cell Reports Methods》上的一篇题为“An integrated pipeline for mammalian genetic screening”的论文中，相关的开源算法可在GitHub上获得。

“STAMPScreen是一种简化的工作流程，使研究人员可以轻松识别感兴趣的基因并进行基因筛选，而无需猜测使用哪种工具或进行哪些实验来获得他们想要的结果。”作者Pranam Chatterjee博士说，他曾是麻省理工学院媒体实验室的研究生，现在是HMS和Wyss研究所的Carlos M. Varsavsky研究员。“它与许多现有的数据库和系统完全兼容，我们希望许多科学家能够利用STAMPScreen来节省时间并提高他们的结果质量。”

Chatterjee和Christian Kramme是George Church实验室的博士候选人，也是Wyss的核心教员和HMS的遗传学教授。他们的研究通过结合数字方法和基因工程的优势，探索了生物生育、衰老和免疫的不同方面的遗传基础。

但这两者都受到了限制。这些算法可以指示基因的表达模式何时发生变化，但没有提供任何关于这种变化原因的见解。当他们想在活细胞中测试一系列候选基因时，并不清楚他们应该进行什么样的实验。许多可用于将基因插入细胞并对其进行筛选的工具都是昂贵、耗时且缺乏灵活性的。

研究人员说：“我们认为必须有一种更好的方法来进行这类研究，当我们找不到一种方法时，我们就自己去创造它。”

Kramme和他的同事们概述了制作一个可以全面运作的端到端基因筛查平台所需的条件。

首先，他们开发了独特的计算算法，可以使用细胞分化的转录组数据并识别关键转录因子。第一种算法对与其他基因高度相关的基因给予高分，这些基因的活性与大的细胞水平变化相关。第二种算法生成网络来表示细胞类型分化过程中基因表达的动态变化，然后应用中心性度量，如谷歌的PageRank算法，对过程中的关键调节器进行排序。

一旦确定了目标基因，STAMPScreen协议就会破坏细胞中的这些基因。研究人员团队系统地评估了多种基因扰动工具，包括人类诱导多能干细胞（hiPSC）中的互补DNA（cDNA）和多个版本的CRISPR。

然后，他们创造了一种新的工具，允许在同一细胞内使用CRISPR和cDNA，以释放这两种方法之间的协同作用。例如，CRISPR可用于关闭基因所有亚型的表达，而cDNA可用于依次单独表达每个亚型，从而允许进行更细致的遗传研究并大大减少非目标基因的背景表达。

然后，可以使用该团队获得专利的名为MegaGate的克隆方法将候选转录因子克隆到带条形码的PiggyBac载体中。MegaGate利用巨核酸酶实现高效克隆，克隆成功率为99.8%，也使他们能够轻松地对载体进行条形码编码。

“MegaGate不仅解决了我们在旧的克隆方法中一直遇到的许多问题，它还与许多现有的基因库（如TFome和Horfome）兼容。你基本上可以从货架上取下Gateway和Meganuclareases，将它们与一个基因库和一个条形码目标载体库组合在一起，两个小时后，你就会拥有感兴趣的条码基因。我们已经用它克隆了近1500个基因，而且还没有失败。”Wyss研究所和HMS的研究生Alexandru Plesa说。

Chatterjee的twitter提要解释说，最后，条形码载体可以在iPSC中以不同的拷贝数进行组合筛选，产生的转录组可以通过基于条形码的测序（批量和单细胞分辨率）读出。

他们还成功地使用了多种方法，包括RNA-Seq、TAR-Seq和Barcode-Seq，来读取hiPSC的遗传条形码和整个转录组，使研究人员能够使用他们最熟悉的工具。

该团队预计STAMPScreen将被证明对多种研究有用，包括通路和基因调控网络研究、分化因子筛选、药物和复杂通路表征以及突变建模。

STAMPScreen也是模块化的，允许科学家将它的不同部分集成到他们自己的工作流程中。

研究人员说：“公开可用的基因数据集中蕴藏着大量信息，但只有我们使用正确的工具和方法对其进行分析，才能理解这些信息。STAMPScreen将帮助研究人员更快地获得灵感，并加快基因工程创新的步伐。”