距离上次更新这个专题后，该教程的原作者更新了一下原教程，使用了一个新的，非常好用的工具，Dsuite进行基因渗入分析，这期的推文就和大家一起回顾并学习一下该工具的使用，加深对基因渗入分析的了解。
首先如果你是第一次或者没有看到之前的文章，先去看看渗入分析的背景介绍和该教程所用的数据的相关背景知识：
然后还有就是旧版的教程，大家有兴趣可以看看，比较一下使用的方法的异同：
准备工作
测试数据的下载
wget https://raw.githubusercontent.com/mmatschiner/tutorials/master/analysis_of_introgression_with_snp_data/data/NC_031969.f5.sub1.vcf.gz
保存好我们的样本名文件，这里除了outgroup物种外有13个物种：
vi samples.txt
###将下面的样本名复制进去
IZA1 Outgroup
IZC5 Outgroup
AUE7 altfas
AXD5 altfas
JBD5 telvit
JBD6 telvit
JUH9 neobri
JUI1 neobri
LJC9 neocan
LJD1 neocan
KHA7 neochi
KHA9 neochi
IVE8 neocra
IVF1 neocra
JWH1 neogra
JWH2 neogra
JWG8 neohel
JWG9 neohel
JWH3 neomar
JWH4 neomar
JWH5 neooli
JWH6 neooli
ISA6 neopul
ISB3 neopul
ISA8 neosav
IYA4 neosav
KFD2 neowal
KFD4 neowal
对Dsuite进行安装：
git clone https://github.com/millanek/Dsuite.git
cd Dsuite
make
Dsuite主要包含三个：“Dtrios”，“DtriosCombine”和“Dinvestigate”不同命令，这里我们计算D统计量主要用到 Dtrios，下面是该工具的帮助文档，大家可以熟悉一下，主要的参数就是-j,主要用于设定计算窗口的大小范围：
Usage: Dsuite Dtrios [OPTIONS] INPUT_FILE.vcf SETS.txt
Calculate the Dmin-statistic - the ABBA/BABA stat for all trios of species in the dataset (the outgroup being fixed)
the calculation is as definded in Durand et al. 2011
The SETS.txt should have two columns: SAMPLE_ID SPECIES_ID
The outgroup (can be multiple samples) should be specified by using the keywork Outgroup in place of the SPECIES_ID
-h, --help display this help and exit
-j, --JKwindow (default=20000) Jackknife block size in SNPs
-r , --region=start,length (optional) only process a subset of the VCF file
-t , --tree=TREE_FILE.nwk (optional) a file with a tree in the newick format specifying the relationships between populations/species
D values for trios arranged according to these relationships will be output in a file with _tree.txt suffix
-n, --run-name run-name will be included in the output file name
实战演示
如Dsuite帮助文本上面所示，该程序可以运行Dsuite Dtrios [OPTIONS] INPUT_FILE.vcf SETS.txt。在我们的例子中，输入文件是NC_031969.f5.sub1.vcf.gz，而sets文件是包含之前写入的样本和物种ID的表samples.txt。因此，启动我们的测试数据集的Dsuite分析：
Dsuite Dtrios NC_031969.f5.sub1.vcf.gz samples.txt
该运行应该在几分钟内就能完成。
现在使用该ls命令查看当前目录中的文件。应该能看到Dsuite已经编写了一些以sample-table文件命名的文件：
samples__BBAA.txt
samples__Dmin.txt
samples__combine.txt
samples__combine_stderr.txt
接下来，查看文件的内容samples__combine.txt，例如使用less命令。您将看到此文件的第一部分具有以下内容
altfas neobri neocan 1378.2 13479.6 4066.95
altfas neobri neochi 2281.67 2322.45 8154.16
altfas neobri neocra 1610.98 1495.17 14174.6
altfas neobri neogra 1618.4 1559.8 14312.1
altfas neobri neohel 1549.77 1416.71 14741.8
altfas neobri neomar 1980.94 1728.7 13168.8
altfas neobri neooli 1668.03 1460.84 14734.4
altfas neobri neopul 1279.66 1164.73 14283.7
altfas neobri neosav 1729.49 1616.15 12626.2
altfas neobri neowal 2525.99 2440.28 8572.34
altfas neobri telvit 2581.12 2688.36 8258.12
altfas neocan neochi 12306.4 1310.06 3745.6
altfas neocan neocra 14200.7 1395.33 4097.46
altfas neocan neogra 14825.3 1436.9 4286.4
altfas neocan neohel 14063.7 1361.83 4102.08
altfas neocan neomar 14794.6 1422.08 4181.25
altfas neocan neooli 14834.4 1408.33 4274.5
...
在这里，每一行显示分析一个三个物种的分析结果，例如在第一行中，Altolamprologus fasciatus（“altfas”）用作P1，Neolamprologus brichardi被认为是P2，而Neolamprologus cancellatus被放置在P3。然后该行的第五和第六列中的数字分别代表着:ABBA位点在该三个物种中的数量(C-ABBA)（其中衍生的等位基因由“neobri”和“neocan”共享）和BABA位点的计数，C-BABA（衍生的等位基因由“altfas”和“neocan”共享）。除了第5和第6列中BABA和ABBA位点的数量之外，第4列列出了“BBAA”位点的数量(C-BBAA)，P1和P2共享衍生的等位基因（因此通过“altfas”和“ neobri“共享）。
你可能会注意到，在此文件中，所有三元组都按字母顺序排序; 因此，P1在P2之前按字母顺序排列，P2在P3之前。然而，如上所述，ABBA-BABA测试基于P1和P2是姊妹物种的假设。当计算给定三个物种的D-统计量时，Dsuite首先重新排列分配给P1，P2和P3的物种（因此ABBA，BABA和BBAA位点的数量也重新排列），这是根据某些规则：
- 在第一组计算中，测试所有可能的重新排列，并且报告每给定三个物种的最低D-统计量，称为D min。因此，D min是给定三个物种中D-统计量的保守估计。此输出将写入具有__Dmin.txt结尾的文件。
- 这样的排列使得P1和P2是给定三个物种的两种物种，它们共享最大数量的衍生地点。换句话说，进行重排以使C-BBAA > C-ABBA和C-BBAA > C-BABA。另外，旋转P1和P2，使得在P2和P3之间共享的派生位点的数量大于P1和P3之间的派生站点的数量。总之，这意味着C-BBAA > C-ABBA >C-BABA。这种类型的重排背后的想法是，共享最大数量的衍生地点的两个物种很可能是给定三个物种中真正的两个姊妹物种，因此正确地放置在位置P1和P2。预计这种假设在某些条件下会持续存在（例如时钟式演化，缺乏同质性，缺乏渐渗，以及泛化的祖先种群），但有时候很难说真实数据集的可靠性。基于这种类型的重新排列的D-统计被写入具有结尾__BBAA.txt的文件。
- 要直接告诉Dsuite哪个给定三个物种应该被视为姊妹物种（因此，应该将其分配给P1和P2），我们可以使用参数
-t或提供包含所有数据集种类的树文件--tree。然后输出将被写入带有结尾__tree.txt的附加文件。这里后面会讲到。
那么，让我们看看如何基于给定三个物种的前两条规则计算D统计量。看看文件samples__Dmin.txt，例如使用less命令：
less samples__Dmin.txt
你应该看到文件的第一部分，如下所示：
P1 P2 P3 Dstatistic p-value
altfas neocan neobri 0.493787 0
neobri neochi altfas 0.00885755 0.3836
neocra neobri altfas 0.0372849 0.013765
neogra neobri altfas 0.0184394 0.258714
neohel neobri altfas 0.0448571 0.113967
neomar neobri altfas 0.0679957 0.0195241
neooli neobri altfas 0.0662179 0.0133793
neopul neobri altfas 0.0470166 0.10957
neosav neobri altfas 0.0338796 0.103889
neowal neobri altfas 0.0172581 0.266909
neobri telvit altfas 0.0203511 0.199163
altfas neocan neochi 0.481745 0
altfas neocan neocra 0.491942 0
altfas neocan neogra 0.497877 0
altfas neocan neohel 0.501518 0
altfas neocan neomar 0.492416 0
altfas neocan neooli 0.504355 0
...
如标题行所示，第四列现在显示每一个给定三个物种的的D-统计量，第五列显示基于对D = 0 的零假设的归一化的p值。
让我们选择一个给定三个物种的例子，看看它是如何出现在三个不同的文件samples__combine.txt中samples__Dmin.txt，和samples__BBAA.txt。我们将选择第一个给定三个物种的例子，包括“altfas”，“neocan”和“neobri”的那一行。要仅从三个文件中查看此给定三个物种的例子的行，可以使用此命令：
cat samples__combine.txt | grep altfas | grep neocan | grep neobri
cat samples__Dmin.txt | grep altfas | grep neocan | grep neobri
cat samples__BBAA.txt | grep altfas | grep neocan | grep neobri
这应该会分别输出以下三行：
###samples__combine.txt
altfas neobri neocan 1378.2 13479.6 4066.95
###samples__Dmin.txt
altfas neocan neobri 0.493787 0
###samples__BBAA.txt
altfas neocan neobri 0.493787 0
这里简单解析一下结果，首先samples__combine.txt品种名字母排序的方式与其它两个文件有点不同，P1在三个文件中保持相同（“altfas”），但是P2和P3的顺序被交换了（“neocan”和“neobri”）。此交换还暗示ABBA，BABA和BBAA模式的计数相应地交换。因此在交换之后并且P1 =“altfas”，P2 =“neocan”，P3 =“neobri”，计数如下：C-ABBA = 4066.95，C-BABA = 1378.2，C-BBAA = 13479.6。因此，“neocan”和“neobri”共享4066.95个衍生位点，“altfas”和“neobri”共享1378.2个衍生位站，“altfas”和“neocan”共享13479.6个衍生位站。有了这些数量，D=（4066.95 - 1378.2）/（4066.95 + 1378.2）= 0.493787。这个数字与Dsuite在这两个文件（samples__Dmin.txt和samples__BBAA.txt。）生成的报告一致。
重复与上一步相同的操作，但这一次使用给定开头为neo的三个物种的，文件samples__Dmin.txt和重新排列不同samples__BBAA.txt。三个“neobri”，“neocra”和“neogra”就是这样一个例子。使用这些命令可以在所有三个文件中查看此给定开头为neo的行：
cat samples__combine.txt | grep neobri | grep neocra | grep neogra
cat samples__Dmin.txt | grep neobri | grep neocra | grep neogra
cat samples__BBAA.txt | grep neobri | grep neocra | grep neogra
结果会分别输出以下的行：
###samples__combine.txt
neobri neocra neogra 3788.23 3552.38 2992.93
###samples__Dmin.txt
neogra neocra neobri 0.0321294 0.145298
###samples__BBAA.txt
neocra neobri neogra 0.0854723 8.58201e-07
文件中的结果samples__BBAA.txt表明，当P1 =“neocra”，P2 =“neobri”，P3 =“neogra”时，则C-BBAA = 3788.23，C-ABBA = 3552.38，C-BABA = 2992.93，因此D =（3552.38 - 2992.93）/（3552.38 + 2992.93）= 0.0854723。
然而，文件中的结果samples__Dmin.txt显示，这次发生了另一次重新排列（因此C-BBAA不大于其他两个计数的重新排列）产生较低的D-统计：P1 =“neogra”，P2 =“neocra” ，并且P3 =“neobri”，则C-BBAA = 2992.93，C-ABBA = 3788.23，并且C-BABA = 3552.38，因此D =（3788.23-3552.38）/（3788.23 + 3552.38）= 0.0321294。
这说明了D-min值，报告了可能的最低D值对于给定三物种的统计，有时选择该三个物种的重新排列，其中P1和P2实际上彼此共享较少的派生位点，而不是它们两者与P3共享。这与ABBA-BABA测试的原始假设相冲突，即P1和P2彼此之间的关系比P3更紧密。在解释Dsuite分析的结果时，应该记住，在文件中报告的D min值__Dmin.txt实际上是D -statistic的保守估计。文件中报告的值以__BBAA.txt结尾为基础，这些值基于确保C-BBAA > C-ABBA > C-BABA的重新排列，通常可以更好地测量D -statistic，但是，最好的选择可能是使用--tree选项运行分析，提供一个输入树，直接告诉Dsuite如何重新排列所有三个物种，这部分就留下次再讲吧，要不然信息量太大大家也不好吸收。