CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工

接前

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1）
上周我写了挑选靶基因的相关工作，但仅仅是查阅数据库数据是不够的，该数据仅仅能够给予一个比较大范围的背景。接下来需要继续查阅文献，缩小范围得到更为精准的证据，有以下几点需要考虑：
1.与要研究的疾病相同或者相似；
2.与所用的材料相同或者相似；
3.与要进行的方法相同或者相似；
4.与研究目的相同或者相似；
5.是否有直接的证据表明该基因相关。

在开始之前仍需要确认的信息

在大数据筛选+文献确认之后，就要开始着手敲除事项，在这之前有一个非常重要的点在很多教程中都没有提及，包括我之前写的sgRNA设计推文CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计

常规情况下：

1. 敲除所有isoform都有的基因片段，以达到全敲的效果；
2. 在保证敲除所有isoform的基因片段之后，尽量敲往前一点，以免太过后面，导致后半部分虽然不完整，但仍有功能；
3. 来自我的好友喜糖的提醒，作为大段敲除，最好是之前敲掉是3的倍数的外显子，以达到移码的效果，使得该位点之后的基因全部错位，以致表达缺失；

根据以上要点，我们不由的思考起来，我们敲除基因，仅仅是简单的敲除掉它的所有亚型的完整性吗？显然不是，我们需要的是，不仅仅敲除该基因表达，更重要的是摧毁该基因的功能！那么就设计到一个非常重要的知识点：基因功能域，所以我们需要通过敲除基因的功能域，从而得到loss of function的效果。
https://www.uniprot.org/uniprot/ 了解一下。

因此，在设计sgRNA之前，我需要搞清楚目的基因的结构域。

以PTEN为例（这竟然是我第一次这么认真看一个基因的NCBI介绍）

1. 无论如何，NCBI在前面：

NCBI_PTEN

这边主要表明PTEN是一个带有类张力蛋白结构域的双特异性蛋白酪氨酸磷酶。和 其他磷酸酶不一样（其他磷酸酶磷酸化蛋白后呈现激活状态），PTEN磷酸酶催化底物磷酸化，从而负性调控细胞内磷脂酰肌醇-3、4、5-三磷酸腺苷（听着像一个信号传导用的什子），并且 负性调控AKT/PKB信号通路，从而起到肿瘤抑制因子的作用。

其次，由非典型(CUG)上游起始位点的使用产生一个较长的同工异构体（PTEN-long或者PTENα），该异构体通过亮氨酸启动翻译，并且被认为优先与线粒体内膜相关联，这种较长的亚型可能有助于调节线粒体的能量代谢。该基因的一个假基因在9号染色体上被发现。选择性剪接和使用多个翻译起始密码子导致多个转录变体编码不同的亚型。

那么接着来看，PTEN到底有多少个亚型，一则可以直接下载PTEN基因序列在snapGene软件查看，也可直接在该基因的NCBI页面上查看。值得注意的是，我们常常在谷歌学术上不停的搜索一个基因相关的文献，但很少注意到NCBI该基因页面下就已经总结好各种相关文献可以直接查阅。

isoform1

2 and 3

2. 参考文献：

image.png

文章总结：

PTEN

3. 其他文献总结：

image.png

磨刀不误砍柴工

在这里我们简单介绍了如何寻找一个基因的功能域，那么根据各自的目的，去选择敲除不同的位置，从而构建合理的实验模型进行研究。如果一开始不够了解该基因的情况，胡乱选一个位点敲除，不仅结果不严谨，容易被人推翻，更是浪费自己的宝贵时间和课题组经费。以上仅仅是举个例子，具体细节仍需要自行把控。

选定位点之后，就可以进行下一步：sgRNA和引物设计
CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后

感谢师兄DZ