CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 5-15 转染验证

基础知识系列链接（节选）：

CRISPR-Cas9学习笔记
Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记
FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing

系列实验链接：

CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 1
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 2
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 3
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 4

这里我不再放详细的实验步骤了，因为我的实验记录本已经详细的记录了实验步骤和条件，没有多余的时间再重新弄一个，可以自行回去查找文献对照protocol

Protocol From Feng Zhang

上次我的day 4做完之后，接着就要转293T细胞来验证一下质粒的效果了。简单描述以下前期的思路（其实是我自己在回顾），先准备好需要用的东西：Cas9 backbone质粒，根据基因靶点将sgRNA设计好（顺带设计一下引物），将sgRNA插入到Cas9 backone质粒中，将质粒转入感受态细胞扩增，提取质粒后酶切验证。接着就是293T细胞转染验证了。

其实就是简单的瞬时转染

使用常规的转染试剂Lipofectamine 3000或者罗氏等其他公司的转染试剂，按照protocol严格操作即可。

1. 注意293T细胞非常脆弱，动作要轻柔。
2. 但我为啥做了10天呢。。。293T细胞是非常好转的细胞，可是我仍然做了好一段时间才达到了所需的转染效率，这跟转染试剂的效率有关。尽量使用新开封的试剂。
3. 另外293T细胞的状态也很重要。
4. 细胞融合度：如果按照protocol，在转染当天70-90的细胞融合度，那就妥妥的12小时之后就长爆了，根本没法在孔板里面待够72小时。细胞一旦超过50%之后就快速增殖了，因此我选择了45%进行转染，24-48 h细胞并不是非常的满，72 h细胞还是OK的。

昨天和今天都提取了基因组DNA，就酱紫。

感谢师兄DZ