春卷00
春卷00

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（4）构建sgRNA+Cas9载体

前期记录

先确定目标基因
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1）
然后对目的基因进行背景调查
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工
设计sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（3）sgRNA及引物设计

读者补充

上次推文我针对sgRNA设计方面增加了一部分内容，有一位特别棒的读者（名：chuxinxzz）在下方给我留言说可以使用Cas9+sgRNA切割效率试剂盒验证切割效率，并且经实践得知，验证结果和实际编辑结果相差无几。感谢他给我的补充，这也是我写下去的动力，毕竟我一个人的精力是有限的，因此不论我好与坏，我都先把自己拎出来，以期待得到其他人的交流和答复，从而学到更多的经验。

昨天和今天

昨天我依照golden gate assembly的方法，参照了张峰老师实验室protocol，使用了BbsI限制性内切酶和T4连接酶，将合成好的sgRNA插入到带有Cas9的质粒中；接着转化到感受态细胞中--复苏感受态细胞后--涂氨苄西林平板过夜培养--今天傍晚挑取单克隆菌落置于氨苄西林+LB培养基中过夜培养，明日即可提取质粒并酶切验证。但由于293FT细胞冻存于液氮罐中，今日打台风没有来得及复苏该细胞，因此转染实验有拖后。

下一步

质粒小提试剂盒
酶切实验使用到的相关限制性内切酶（BbsI）
准备好293FT细胞（应提前准备，一旦酶切验证成功，立即转染筛选），也就是在这一步，可以使用上文提到的读者建议用的酶切效率试剂盒。如此看来，可以节约下至少4-6天的时间，当真是好办法的。

感谢师兄DZ

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