慢病毒包装基础原理&实验

  最近需要用到慢病毒包装目的基因进行表达，这篇笔记就是简单的记录了一下我的慢病毒相关知识的学习~

---

Background

  慢病毒载体（lentivirus vector, LV）是一类来源于逆转录病毒的载体，慢病毒之所以是称为慢病毒，是因为感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前，经历较长的潜伏期，之后缓慢发病。
  1：最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统等。

  2：慢病毒的病毒结构
  病毒结构蛋白gag、pol和env。gag基因编码病毒的核心蛋白如核衣壳蛋白（p7）、内膜蛋白（p17）和衣壳蛋白（p24）；pol基因编码病毒复制相关的酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。
  病毒调节蛋白rev,tat。rev主要参与蛋白调节的表达水平，tat参与蛋白转录的控制，与病毒的长末端重复序列（long terminal repeats, LTRS）结合后促进病毒的所有基因的转录。
  四个辅助蛋白，即vif、vpr、vpu、nef，帮助病毒包装完成

慢病毒的病毒基因

How？----慢病毒表达体系

  讲了基本的原理，那么慢病毒是如何包装的？根据上面的知识点是只需要表达这些病毒结构的蛋白就对了嘛？如何去实现呢？
  把这些基因都整合到病毒的表达载体质粒上，然后利用质粒表达各部分基因，就可以组装成病毒了！

  Q：如何保证包出来的病毒不会有生化危险呢？因为这些可是HIV的病毒体系呀
  A：将病毒体系拆分一下，病毒表达体系有2质粒系统，3质粒系统，4质粒系统。

  Q：这些质粒系统有什么区别呢？
  A：他们的安全系数不一样，2质粒系统和3质粒系统有可能产生有活性的病毒，4质粒系统主要是：pGag/Pol、pRev、pVSV-G，此外，还有一个可以放置目的基因序列的载体。这个体系产生活性病毒的可能被大大降低。(5′端LTR被替换成了CMV，3′端LTR被换成了SV40 ployA 这两个都是可以增强表达，减低病对人体毒危害性)

我们来看一个4质粒系统的
pMDLg/RRE:这个质粒携带了gag,pol,rre元件

质粒一 pMDLg/RRE

pRSV-Rev ：这个质粒携带了，rsv,rev元件

质粒二 pRSV-Rev

vsvg质粒：携带了vsvg元件，CMV启动子等

质粒三：vsvg质粒

核心质粒：携带了SV40, RRE，CMV,目的序列

核心质粒

---

拥有了这四个质粒以后，就可以去准备慢病毒的包装实验了，

pre：一定要用去内毒素的试剂盒去提质粒，如果质粒没有去内毒素的话，会很大的影响转染的效率。可能会导致结果失败！

(什么是内毒素？它是革兰氏阴性菌的细胞膜上的一种脂，伴随着细胞的死亡会大量的释放出来，如果进入到细胞内的话会影响细胞活性)

我用的是lip2000包病毒，根据lip2000的说明书进行操作。附上说明书https://wenku.baidu.com/view/6fc64b4adaef5ef7bb0d3c0b.html?rec_flag=default

Ref：
1：慢病毒载体及其研究进展https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6000409/
2：lip2000说明书
https://wenku.baidu.com/view/6fc64b4adaef5ef7bb0d3c0b.html?rec_flag=default
3：慢病毒包装实验参考https://wenku.baidu.com/view/deca10fd770bf78a652954f1.html?rec_flag=default&sxts=1564996921080

---

文章同步到我的知乎专栏啦~欢迎一起讨论学习呀https://zhuanlan.zhihu.com/p/76783602