REM sleep–active MCH neurons are involved in forgetting hippocampus-dependent memories
Literature_Reading/sleep
Literature_Reading/memory
Literature_Reading/hipocampus
临近考试，需要复习，可能要鸽几周了
这篇文献是师姐让我看的，关于 REM 睡眠的功能
在这里主要讲一些文章的思路
其中用到的很多实验技术和方法我还不甚了解 (需要整理)
最后谈谈我们讨论的一些想法
这篇文献在微信工作号也有很好地解读，大家可以去看看：
睡眠时遗忘细胞会清理记忆
下面是我个人的解读
However, little is known about the neural mechanisms involved in forgetting during sleep. In addition, whether forgetting occurs during non–rapid eye movement (NREM) sleep or REM sleep is unclear.
一般我们认为，记忆在白天是由于各种活动而形成，而记忆的巩固和遗忘发生在睡眠时期。(记忆这一块我还没深入去看，只能说个大概的方向)。
关于在睡眠时候的遗忘机制很少有研究报道，甚至遗忘是发生在睡眠的 NREM 期还是 REM 期也说不清。
The hypothalamus is a center for instinctive and homeostasis-related behaviors. Melanin-concentrating hormone (MCH) neurons are exclusively located in the lateral hypothalamic area (LHA) but project broadly throughout the brain (10). MCH neurons also have a prominent role in sleep– wakefulness regulation. Activation of MCH neurons increases time in REM sleep, whereas inhibition reduces transitions into REM sleep.
下丘脑是和激素稳态以及本能行为调控有关。而 MCH 神经元(黑色素浓缩激素神经元)位于下丘脑的外侧区(LHA)，与睡眠-觉醒周期的调节密切相关。激活 MCH 神经元会增加 REM 睡眠，抑制则会减少。
文章关注点的重点是：睡眠 和 遗忘。睡眠关注的是和 REM 密切相关的 MCH 神经元，那么和遗忘相关的自然就相当是海马区(hippocampus)
所以有了假设后，作者就开始做实验验证两者都关系：
01. direct innervation to the hippocampus
为了验证和海马相关的直接神经元，首先他们在海马的双侧 CA1区注射了retrobeads (retrogradely transported beads 微珠？不是病毒？我也不清楚是什么需要查)
发现确实下丘脑(hypothalamus)确实有很多神经元投射到海马CA1区 (Figure 1A， 虽然 DBMS 是最多的，但是文章关注点是hypothalamus，只要有足量的数据支持 hippocampus 和 hypothalamus有直接联系，就能说明问题)
随后由做了免疫组化试验，证实下丘脑 MCH神经元有大量的投射到海马区(hypothalamic MCH neurons densely projected to the hippocampus.) (Figure 1B)
02. to confirm where is the MCH nerve terminals
上面已经验证了 MCH 神经元 与 海马有直接投射
接下来是实锤 MCH 神经元的神经末梢就在海马里大量分布
他们繁殖出了MCH-tTA; TetO Yellow Cameleon-Nano50 (YC) mice 和 Orexin-tTA; TetO Yellow Cameleon-Nano50 (YC) mice 两种转基因鼠。在MCH-tTA; TetO YC 小鼠中，MCH 神经元会表达可显色的 YC。
从 Figure 1C 中可以看出，MCH 神经末梢在海马的背侧大量存在，而Orexin神经末梢在海马区相当稀少。
实验的顺序？
03.To evaluate MCH neuron effects on memory,
ok 既然知道两种的关系，那下一步就是看看去掉 MCH 神经元对小鼠行为有什么影响。
(文章关注的重点是 REM 睡眠对记忆调控，记忆和海马的研究已经有一定理论基础)
所以
- 要有 turn on 和 turn off MCH 方法
- 要有一个行为范式来评判 记忆是否遗忘
文中先用的化学遗传的方法(chemogenetics)调控MCH 神经元的开关
选择了新物体辩识实验 [a novel object recognition (NOR)]，条件情景恐惧[a contextual fear conditioning (CFC) test], 还有后续的条件恐惧[cued-fear memory]，水迷宫[the Morris water maze] 等行为范式作为评价小鼠遗传程度的测试。
(具体的实验细节和原理我还不太懂，需要细看）
激活 MCH nerons (activation)
- MCH-Cre mice
- AAV9-CAG-FLEX-hM3Dq- mCherry
- 当注射 CNO (clozapine-N-oxide) 时，hM3Dq受体被激活，产生动作电位。(相当于MCH nerons被激活)
抑制 MCH nerons ( inhibition)
- MCH-Cre mice
- AAV9-CAG-FLEX-hM4Di-mCherry
- 当注射 CNO 时，hM3Di受体被激活
(有关CNO, hM3Dq, hM4Di, DREADDs的总结放另一篇里面)
试验流程如下：
- 让小鼠进行 NOR/CFC 记忆 (对应 Figure 1E 的 phaseⅠ)
- 记忆10min 后注射 CNO，激活或抑制 MCH神经元，同时注射生理盐水作为对照
- 休息1.5个小时，(小鼠有睡觉吗？？)
- 重新放回笼子(新物体/无电击)，观察小鼠行为，判断小鼠记忆受损程度(遗忘)
结果：
- 激活MCH 神经元(hM3Dq+)后, 小鼠的 NOR/CFC 记忆收损，表现不如生理盐水组
- 抑制MCH 神经元(hM3Dq+)后, 小鼠的 NOR/CFC 记忆提升，表现优于生理盐水组
上述结果表明：
MCH 神经元的激活或抑制与 NOR/CFC 记忆相关(NOR是典型的hippocampus-dependent memories)，MCH 神经元参与了遗忘的过程。
04. ablate MCH neurons ablated
化学抑制 MCH neurons 神经元不够彻底，而且 MCH neuron 也可能释放其他神经递质产生影响。
另一个问题是，需要多少时间就会遗忘。
To assess memory after a long retention period, MCH neurons were ablated by expressing diphtheria toxin A fragment (DTA) under control of the tet-off system (15). After doxycycline (DOX) removal from diet, almost all pro-MCH mRNA- expressing neurons were ablated [MCHN(−)] in contrast to mice fed with DOX-containing chow [MCHN(+)]
所以他们又做了将 LHA MCH 神经元杀死的实验。
他们引进了 tet-off 系统，大概的意思是在这个系统中小鼠的MCH neurons会表达 DTA(白喉毒素A片段)。当DOX(强力霉素)能持续摄入时，MCH neurons正常生长，或 DOX 从小鼠的饮食中移除，小鼠的MCH neurons会被慢慢杀死，pro-MCH mRNA也不会再表达。(Figure 1J)
在杀死MCH神经元后[MCHN(-)]，发现小鼠的 NOR记忆至少能维持48h (Figure 1J)。而且依赖于海马的条件场景恐惧记忆(CFC)，空间记忆(spatial memory, the Morris water maze)也变得更好了(Figure 1KN)。但是，依赖于杏仁核(amygdala)的另一种恐惧记忆则不受影响(Figure 1M)。
说明 MCH神经元影响的是依赖海马的记忆(hippocampus-dependent)。
(关于 contextual-fear 和 cued-fear 放另一篇讲)
05. To further clarify a role for MCH neurons in memory
为了进一步说明 MCH neurons 的功能，研究者又引入了 光遗传、膜片钳电生理
光遗传：
- MCH-tTA; TetO ChR2 mice (用这个转基因鼠)
- channelrhodopsin2 (ChR2) (光刺激时激活 MCH 神经元)
- wireless photoillumination (无线光激活器)
- (正文没说用什么病毒，sm 里面估计有)
- (为什么用这种老鼠我也不清楚，以后再补上）
结果：Figure 2 A-C
Although activation during encoding or retrieval did not affect NOR memory, activation during the retention period significantly impaired memory.
图中可以看出，在 encoding 和 retrieval 阶段激活激活 MCH 神经元对 NOR /CFC 记忆影响不大，但是在休息期( retention period)激活 MCH 神经元，NOR /CFC 记忆能力显著下降。 (也没有说在 retention 的1小时里，小鼠是不是有在睡觉？)
注意 Figure 2 A-C 刺激的 MCH 神经元的胞体
膜片钳电生理：：
- hippocampal pyramidal CA1 neurons were patch clamped
- MCH nerve terminals were optogenetically stimulated
- 还是用上面的老鼠，切片，体外电生理记录
- 膜片钳夹海马 CA1 区的锥形细胞，蓝光激活MCH神经元
这里刺激的是 MCH 神经元的轴突末梢，这个轴突末梢在海马区
结果：Figure 2 D-J
Blue light significantly decreased the firing frequency of hippocampal pyramidal neurons, whereas the frequency and amplitude of inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) were markedly increased, suggesting enhancement of g-aminobutyric acid–mediated (GABAergic) inhibitory inputs
蓝光激活 MCH 神经末梢后，海马锥形神经元细胞放电频率下降，而抑制性的突触后电流(IPSCs) 显著增加。
说明：MCH 神经元激活会增强海马 CA1区锥形神经元细胞的 GABA 能抑制性输入 (???这里感觉逻辑有点怪，我是不是缺了什么背景知识)
最后感觉不过瘾，在活动小鼠上刺激 MCH 神经元的轴突末梢，并重复 NOR/CFC试验，结果一样。在 retentoin期激活MCH 神经元的轴突末梢会损失NOR/CFC记忆
06. To reveal MCH neuron activity across physiological sleep–wakefulness
虽然之前的研究表明，MCH 神经元在 REM期活跃，但还是得证明一下。
所以他们又做了钙成像试验。
- EGG and EMG (分析小鼠是处于 wake,NREM,还是 REM 哪种状态)
- fiber photometry (纤维光度法？？估计就是来激活并记录钙信号的光纤)
- MCH-tTA mice (不知道为什么用这种老鼠)
- AAV9-TetO-GCaMP6 (钙离子浓度探针，钙离子浓度高，亮)
We inserted fiber optics into the LHA and recorded the population activity of MCH neurons in freely behaving mice
结果：Figure 3 A-D
不出意外地发现，MCH 在 REM 期更活跃 (Ca2+浓度高)
(虽然wake 时候也有，但是没有 REM 那么显著)
？？ 为什么 wake 的状态也有 MCH 神经元在活跃
好气哦！
所以他们又做了个单细胞水平的钙成像试验。
- MCH-Cre mice (我真不知道为什么要用这老鼠)
- AAV9-CMV-FLEX-GCaMP6f (GCaMP6f 另一个钙离子探针，我不知道区别)
- microendoscopy (显微内窥镜)
嗯，这些舒服了
结果发现，MCH 神经元里面有三个亚群：(Figure 3 E-H,J)
- 一部分只在 wake 的时候放电(兴奋)
- 一部分只在 REM 期兴奋
- 还有一小部分是在wake 和 REM 期都兴奋的
- J 为单细胞层面，在不同的 wake-sleep stage 钙离子活动状态，和之前结果一致
而且从位置来看，这三类细胞随机分布在 LHA(背侧海马)上 (Figure 3 I)
The presence of these subpopulations suggested the possibility of different roles for wake-active and REM-active MCH neurons in memory.
这里的实验结果不仅解释了为什么上一个试验中，在 wake 的状态也有 MCH 神经元在活跃。
实际上，MCH神经元在动物清醒时和食欲有关。这恰恰说明了 MCH 神经元在清醒和睡眠状态有不同的功能。
07. To reveal functional differences for REM-active versus wake-active MCH neurons in memory
(1). 首先证明MCH neurons 确实在睡眠时参与了记忆的调控
(2). 再证明MCH neurons 在 REM睡眠时 参与了记忆的调控
所以他们想阶段性地沉默 MCH 神经元，看小鼠的 NOR 测试表现
- MCH- tTA mice
- AAV9-TetO-ArchT-EGFP (我好像发现一个规律，tTA和TetO搭配，cre 和 flex 搭配)
- ArchT (neural silencer Archaerhodopsin-T, 沉默神经元活动)
- sleep–wakefulness states were automatically discriminated by analysis of EEG, EMG, and locomotor activity in real time (清醒睡眠阶段自动检测)
结果：(Figure 4F，其他图都只是说这个试验做的没问题)
- 在 REM期抑制MCH 神经元能显著提高小鼠在 NOR 测试中的实验，即在 REM期抑制MCH 神经元能“抗遗忘”
- Figure 4G 是想说明，在抑制MCH 神经元活动是，没有影响小鼠的节律(wake-sleep stage)
最后总结一下这篇文章用到的，但是我还不太懂的方法和技术，以后慢慢解读。
- 用哪种老鼠 (MCH-tTA mice, MCH-cre mice)
- retrobeads (retrogradely transported beads) 是什么玩意？
- DREADDs 技术
- tet-off system
- contextual-fear 和 cued-fear
- 钙成像、光遗传、膜片钳电生理，内窥镜，EEG&EMG (比较大，慢慢了解）
作者：发哥
链接：发哥的档案室 -
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