实验复盘（一）-------质粒提取&酶切

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  最近一直在操心质粒构建的事情，前期基础不够，踩了太多的坑。今天来做一个小小的梳理和总结。（遇到的失败挺多的，但是咱也得好好总结和吸取经验和教训，好好复盘！）

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Part 1：质粒的提取

  有一些分子经验的童鞋对质粒的提取肯定不陌生。现在的试剂盒商业化都非常成熟了，我用的时天根的试剂盒提取质粒，我这里贴一个protocol： 天根质粒小提试剂盒说明书
             咱们在做实验之前，一定要好好的仔细研究一下说明书呀！

试剂盒里的成分

   在做实验之前，首先得看一下，试剂盒里的组分是不是都在，我就有一次碰到buffer P1 没了的情况，然后自己根据网上的配方，现配一个，也能提取。

然后仔细看一下注意事项：

注意事项

需要知道以及检查的是
1 ：不同拷贝数的质粒最后提取的得率是不一样的
2：P1有没有加入RNA酶得检查
3：溶液是否出现沉淀？
4：过滤的柱子是不是平衡了？
5：最后PW是不是加入无水乙醇了？

后续的操作步骤按照说明书上来。质粒小提的话，有几个点需要注意：

1： 菌体在加入P1以后是不是完全吹匀了？

2：加入P2的时候，裂解时间不能太久，直到溶液澄清，那么问题来了，溶液是否澄清了呢？什么叫做澄清了？

裂解完全图例

图片来自于： 天根小提试剂盒官网

3：在加入P3的时候，有没有立刻混匀？为什么加入P3以后会出现大量的沉淀？沉淀到底是什么?

  大家可以在这一篇帖子中找找答案！好好想想，沉淀里面都有什么，推荐一个优秀的质粒提取原理的帖子：https://zhuanlan.zhihu.com/p/26187134
（看完之后，觉得好好学生化还是很重要的！）

4：在加入PW以后，有没有开盖晾一会呢？为什么要开盖晾一会？

因为PW里面加了无水乙醇，开盖的目的是为了让它挥发掉，要不然会影响后续的酶切等操作效率。

5：加多少体积的水去洗脱呢？

如果菌液体积有点少的话，不要加太多的buffer去溶解。质粒浓度会低。

6：如果洗脱的体积比较大，质粒浓度低怎么办，有什么办法可以浓缩质粒，提高浓度吗？

有办法！

质粒浓缩

我们来思考几个问题：为什么要加入醋酸钠？为什么要加入无水乙醇目的是什么？
钠离子可以和DNA结合，无水乙醇可以很好的沉淀DNA复合物。
为什么后面要加入70%的无水乙醇洗涤？
去掉盐离子等杂质
（PS：有想过柱子的方法，利用吸附柱去回收DNA，这种方法虽然很方便，但是我认为不是最优解，因为过柱子的损耗率有点大，如果质粒的总量太低的话，不推荐用过柱子的方法去浓缩DNA）

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Part2:酶切

一定要看内切酶的说明书呀！酶切的buffer一定要选对！NEB的内切酶的话，可以对照一下NEB的buffer，确定酶切效率！
举个：

EcoRI 说明

酶切protocol

buffer的选择

一般拿到质粒以后，如果不测序鉴定的话，还是需要进行酶切鉴定来看一下到底对不对。这个时候需要选在合适的内切酶来切。举个例子：

酶切的质粒以及酶切位点的选择

从这个质粒的图谱可以看得到我的质粒大小是4.4K，选择这两个酶切位点以后，酶切大小片段应该是约为400bp和4000bp左右，预期应该是2条带。
实验预期总是很美好，现实bug太多了！
上胶图：

酶切体系为10ul,质粒总量为500ng左右，加了1ul酶，37度水浴3h，取了5ul体系跑胶
跑胶是1%的琼脂糖胶，120V, 20min然后去照胶

跑胶结果

现象：
1：双酶切出现了3条带，地下两条带大概在400bp和600bp
2：EcorI出现了2条带，底下一条带大概在1k左右
3：BamHI只有一条带

提问：
1：如何鉴定，质粒是不是完全切开了？
2：双酶切出现，是质粒有问题吗？
3：有没有对照？

胶图的问题：
1：没有对照体系的话，很难分清楚到底有没有酶切成功
2：从胶图上看，marker不是很亮很清楚
3：双酶切出现3条带，说明酶切位点或者是质粒有问题。

进一步排查问题并且改进：
1：marker多上一些
2：加上对照，重新跑
3：跑胶的时间长一些
4：原胶的话可以再多跑一会，看看条带能不能分开，确定酶切效率

胶图二，多跑了20min, 120v

1%的琼脂糖胶，120V, 30min然后去照胶（做验证）

胶图三

胶图的问题：
marker感觉还是没跑开，而且圆圈中，未酶切的质粒只有一个条带，需要重新评估一下酶切的操作步骤为什么没有之前跑质粒的时候出现3条带。此外，应该多酶切几个小时再看。如果还是这样的话得去检查一下酶切的buffer和酶的效率问题。

关于双酶切三条带的问题
我在EcoRI的上下游找到位点，然后找到了PdmI，看了一些酶切位点，真相了，下次用高保真的酶去切。

非特异性的酶切结果

Ref:
1:天根小提试剂盒
2:NEB EcoRI
3:知乎专栏