P.364核酸检验基本技术

第一节 分子生物学基本知识

一、DNA与RNA

DNA 脱氧核糖核酸
遗传信息--核苷酸排列顺序、以碱基互补维持双螺旋结构
DNA为长丝状分子互相纠缠、其溶液十分黏稠。
溶液对紫外线有最强吸收、用260 nm波长测DNA溶液浓度。DNA变性后OD值会↑
因DNA不溶于乙醇、常用二倍量乙醇沉淀DNA
在变性温度时、黏性突然降低。
淬火--为了保持DNA单链状态
DNA变性后溶液冷却、DNA会自动恢复双螺旋结构

---

RNA 核糖核酸
起遗传信息传递作用&指导合成蛋白质
病毒中RNA也保存遗传信息

• 含有核糖、不是脱氧核糖
• 胸腺嘧啶都代之以尿嘧啶

二、DNA的复制和修复

限制性核酸内切酶--不是合成DNA的必要条件
DNA多聚酶：DNA合成中、单核苷酸分子以共价链连接在3’末端的羟基上。
大肠菌DNA修复：填补缺口最重要的酶--DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段没有5’-3’外切酶活性）意义：保证合成DNA时的准确性
DNA复制最主要的酶--DNA聚合酶Ⅲ（具有3’-5’外切酶活性的亚基是：ε亚基）

三、转录

DNA指导的RNA合成过程。
DNA双链解旋，解旋部位称启动子。
大肠菌RNA聚合酶有5个亚基、 σ亚基有启动子作用

四、翻译

• tRNA：搬运氨基酸
• rRNA：构成核糖体骨架 ribosome
• mRNA：决定蛋白质结构

DNA3个终止密码子：UAA、UAG、UGA
真核生物 核糖体 的5种组蛋白、H1在进化中最不保守。
核糖体上、2个位置上暴露出mRNA分子相邻的2个密码子（蛋白质合成结束？我不懂）

第二节 分子生物学基本技术

一、质粒DNA的分离、纯化和鉴定

质粒--染色体外的稳定遗传因子。
大小从 1~200kb、为双链、闭环的DNA分子，超螺旋状态在细胞中。
具有自主复制和转录能力。
细菌质粒是常用载体、质粒载体是天然质粒的基础上人工构建的。
相比天然质粒、质粒载体带有选择性标记基因和人工的含多个限制性内切酶识别点位的多克隆位点序列。
理想克隆载体的特性：

1. 分子量小、多拷贝、松弛控制型
2. 具有多种常用限制性内切酶的单切点
3. 能插入较大的外源DNA片段
4. 具有容易操作的检测表型

常用质粒载体大小1~10kb
细菌中分离质粒DNA的3个基本步骤

1. 培养细菌使质粒扩增
2. 收集和裂解细胞
3. 分离和纯化质粒DNA

加入抑制蛋白质合成的抗生素、细菌停止繁殖后质粒仍然在复制→提高质粒的收获量。
溶菌酶破坏菌体细胞壁→十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton X-100裂解细胞膜→用强热、酸、碱处理→细菌的线性染色体DNA变性、质粒的共价闭合环状DNA双链不会分开→外界条件恢复→线性染色体DNA片段难以复性、而质粒DNA双链恢复超螺旋分子→溶解状态于液相中
离心除去DNA片段和细胞碎片→酚处理除去核酸酶等蛋白质→乙醇沉积→将质粒DNA从上清液沉积下来→获得高浓度的质粒溶液。
超螺旋DNA、提取过程还会产生开环DNA--松弛型环状分子（双链中有1条发生断裂）

二、基因组DNA的提取

利用基因组DNA较长的特性，将其与小分子DNA分离
异丙醇or乙醇、即沉淀成絮团、玻棒取出。
构建基因组文库、初始DNA长度必须＞100kb
进行RFLP和PCR分析、DNA长度可以短至50kb、＞该长度，可以保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下）、&保证包含PCR扩增的片段（2kb以下）

三、RNA的提取和cDNA合成

细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法
总RNA可利用mRNA 3‘末端含多聚（A）+的特点→得到较纯mRNA
mRNA在70%乙醇中、-70℃可以保持1年以上
RNA→酶促反应、逆转录合成→cDNA

四、DNA酶切及凝胶电泳

限制性内切酶切割双链DNA（一段限制性内切酶识别序列）
分为3类。其中Ⅱ类限制性内切酶广泛应用。
Ⅱ类限制性内切酶识别长度为4个或6个核苷酸的回文对称序列。
DNA→限制性内切酶切割→许多一定长度的片段→电泳分离不同长度片段→特征性图形→DNA电泳图谱，又称DNA物理图谱，以直线or环状图示表示
一般DNA电泳用量为0.5~1 μg、反应温度大多37℃
质粒DNA酶切用量1μg DNA加1单位酶、消化1~2 h；完全酶解必须增加酶的用量2~3倍、时间延长

• 不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度200bp~50kb的DNA片段（水平电泳）
• 聚丙烯酰胺分离小片段5~500bp（通常垂直装置电泳）

电泳完毕→溴化乙锭染色（诱变剂）--302nm紫外光下发橙色荧光

第三节 探针和杂交技术

• DNA双链解旋形成单链--DNA的变性
• 碱基配对重新形成双链--DNA的复性
• 复性过程中、不同来源互补序列形成稳定杂合双链DNA的过程--分子杂交
• 带有可识别标记的已知核苷酸序列--探针
• 根据探针测知对应序列的存在--杂交技术
• 随机合成法标记核苷酸探针最简单有效，也可使用PCR反应。
  DNA探针（最常用）、RNA探针（信号强、效果更好）

分子杂交分类

1. Southen杂交：被检对象为DNA、探针为DNA\RNA
2. Northen杂交：被检对象为RNA、探针为DNA\RNA
3. 其他：斑点杂交、狭槽杂交、原位杂交

3种固相支持体可用于杂交
硝酸纤维素滤膜（最多选）、尼龙膜、Whatman541滤纸

第四节 扩增技术

PCR（聚合酶链反应）--选择性体外扩增DNA/RNA的方法
3个基本步骤：

1. 变性：双链DNA片段在94℃下解链
2. 退火：2种寡核苷酸引物在适当稳定（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对
3. 延伸：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。

三个基本步骤一个循环、25~35轮循环扩增10^6倍

PCR反应中主要成分：

1. 引物：特异性由一对上下游引物决定
2. 4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）:理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。
   当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。
   4种dNTP的浓度应该相等。
3. Mg2+：Mg2+浓度范围0.5~2mmol/L
4. 模板：必须以DNA为模板扩增、模板DNA可以是单链、双链、线状、环状分子（线状分子稍好于环状分子）
   影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。
5. Taq DNA聚合酶：活性半衰期92.5℃-130 mins、95℃-40 mins、97℃-5 mins。
6. 反应缓冲液：一般含10~50 mmol/L Tris·Cl，20℃下pH 8.3~8.8，50 mmol/L KCl和Mg2+

第五节 高通量检测技术

生物基因组是一个极其巨大的分子。
一次测定中、获得成百上千反应的结果--高通量检测技术
生物芯片发展最快、应用最广泛。
生物芯片包括：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片
根据原理：元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片
基因芯片--也称基因微阵列技术
90%用于基因表达谱分析、病毒基因分型、SNP研究、8.5%芯片临床诊断
基因芯片优越性：

1. 高通量，同时监控多种微生物
2. 提高特异性，多条探针杂交、克服PCR易污染的特点
3. 克服窗口期漏检

基因芯片在SARS病毒的鉴定中发挥了很大作用