第22周 2018— 10.14-10.22
文章题目： Long non-coding RNA-dependent mechanism to regulate heme biosynthesis and erythrocyte development
doi: 10.1038/s41467-018-06883-x.
2018年10月发表在Nat Commun.
导读
这是一篇以实验为主的文章，通过RNA-seq测序选了一个lncRNA, 然后通过大量的实验方法讲了一个lncRNA的功能和机制的故事。这篇文章主要学习他们是怎么对一个具体的lncRNA进行功能验证，又是从哪些方面探索了一个lncRNA相关的机制？学习的目的是了解验证lncRNA的功能和机制应如何设计实验。
摘要
研究问题： 血红素作为酶的辅基和血红蛋白的结构成分对红细胞的发育和功能具有重要的调节作用。lncRNA调控多种生理和病理过程，是否对血红素也有调节作用还不清楚。
研究结果：他们发现了在人的红细胞发育成熟中lncRNA(UCA1)对血红素的调节机制。首先UCA1的表达量在红细胞成熟的过程中动态变化，在血红素合成阶段表达较高，敲低UCA1会显著抑制血红素的合成和红细胞的分化。
具体机制：UCA1作为一个架构RNA与PTBP1蛋白相互作用，并招募PTBT1与ALAS2的mRNA结合，参与血红素的合成调节。
背景
血红素作为酶的辅基和血红蛋白的结构成分对红细胞的发育和功能具有重要的生物学作用，如作用在电子转导和氧气运输，通过对自身的合成对红系分化的调节作用，辅助红系分化的主要调节因子GATA1促进成红细胞的产生和维持。
血红素的合成是在红细胞的祖细胞也就是成红细胞时期开始，合成的第一步也是限速的一个步骤是ALAS2基因对血红素合成的催化。ALAS2基因是红细胞特异的基因，血红蛋白的组装也需要ALAS2基因的表达，ALAS2的缺失突变会导致血红素合成受阻，造成严重的贫血和胚胎致死。ALAS2的表达受转录和翻译水平影响，转录水平上，GATA1结合在ALAS2基因的promotor和intron区域内的GATA motif上，从而激活转录。铁应激蛋白和调节蛋白也参与调控ALAS2的蛋白合成。
lncRNA作为蛋白编码基因和非编码基因的重要调节因子在生理和病理细胞过程中发挥着不同的作用，包括在正常和恶性的造血系统中。lncRNA可以和DNA、RNA和蛋白质相互作用调节染色质的修饰，转录，pre-mRNA的剪接和作为蛋白复合物的架构分子发挥功能。尽管有很多红细胞特异的lncRNAs被发现，但是只有少数部分的lncRNA的功能被证明。如lincRNA EPS和lncRNA Fas-antisense 1促进红细胞的祖细胞的生存；lnc-EC1 和 lnc-EC6 调节成红细胞的脱核；lncRNA-αGT促进鸡中 α-珠蛋白的激活等。
UCA1最初是在膀胱癌中发现的，在膀胱癌、急性髓系白血病、乳腺癌、结直肠癌等多种癌症中证明具有致癌作用。尽管UCA1的致癌作用在多种癌症中被研究，但其对发育和分化的生理性作用还不是很清楚。
研究结果
1. 根据差异分析和表达量选择了一个lncRNA
UCA1在红系分化表达量的差异变化
细胞来源：从人脐带血中提取CD34+祖细胞，然后诱导分化。
8天后，90%的细胞为成红细胞，14天后细胞开始脱核（红细胞成熟末期），分化时期的确定是通过联苯胺染色和FACS分选。
对 4天、8天、11天和14天的细胞分别进行RNA测序，然后差异分析找到差异的lncRNA, 他们只对成红细胞时期（血红素合成的起始时期）上调的lncRNA感兴趣。 UCA1是其中一个在成红细胞时期高表达的一个lncRNA。
然后通过 qRT-PCR验证UCA1在day 8是否真的高表达。
总结：不同培养时间的细胞代表不同的分化时期，先进行RNA-seq测序，然后差异分析找到在特定时期高表达的一个lncRNA，并通过qRT-PCR进一步验证该lncRNA的表达量。
2. 敲低该lncRNA验证其功能
UCA1敲低通过影响血红素的代谢阻碍了红细胞的发育成熟
通过shRNA( short hairpin) 敲低UCA1,然后FACS分选和 Wright-Giemsa染色确定细胞时期，然后对UCA1敲低的细胞做RNA-seq测序，并进行差异分析和GSEA分析。GSEA的结果显著富集在血红素的代谢通路。另外，UCA1敲低后，除了 β-globin其他红细胞发育重要的调控因子（KLF1, LMO2, GATA1, TAL1), 细胞质成分（EPB41) 和珠蛋白亚基 (α- and γ-globin）都没有变化。
总结：shRNA 敲低lncRNA, 然后对敲低后的细胞测序，做差异分析和GSEA分析。
3. lncRNA通过什么作用方式发挥功能？与蛋白质？RNA或者DNA?
UCA1与RNA结合蛋白PTBP1相互作用
首先定位，确定lncRNA是在细胞质还是细胞核。他们原文杂交的方法识别到UCA1是胞质RNA。胞质RNA通常与RNA结合蛋白作用发挥功能。因此，他们接下来做了UCA1的pull-down实验和MS质谱分析，鉴定UCA1潜在的相关蛋白。发现PTBP1可能是UCA1的一个潜在蛋白，并通过RIP实验验证。
总结： lncRNA的作用方式的确定：1）首先进行lncRNA细胞定位，如果是在细胞质中，一般是通过与蛋白质结合相互作用；如果在细胞核中可能是与DNA或RNA相互作用。2）通过pull-down实验和MS分析鉴定RNA潜在作用的蛋白，再通过RIP验证。
4. lncRNA与蛋白的作用方式对生物学过程的作用是什么？
UCA1和PTBP1与血红素的合成
知道了UCA1与PTBP1，那么他们相互结合发挥的功能是什么？首先是敲低PTBP1，然后进行RNA-seq测序，发现PTBP1的下调与血红素的代谢，E2F等相关。GSEA的结果也显示这些差异基因与血红素代谢相关。同时他们还对UCA1和PTBP1分别敲低的差异基因进行overlap，找到共有的基因，共有的基因的GSEA和GO富集分析结果都显示与血红素代谢相关。
总结： 确定lncRNA的作用方式后，继续验证lncRNA和作用蛋白的功能，通过敲低作用蛋白，然后测序，差异基因和GSEA和GO富集分析等方法探索其功能。
5. lncRNA与蛋白的结合是否对所关注的生物过程的关键基因有作用？
PTBP1蛋白, UCA1 RNA, ALAS2 mRNA 形成蛋白质–RNA复合物
为了分析PTBP1与UCA1通过怎样的物理相互作用调节血红素的代谢，他们通过检测血红素合成的基因是否与PTBP1和UCA1有相互作用。
通过RIP，发现PTBP1与血红素合成的多个mRNA相互作用，如ALAS2, PPOX, FECH*，但是对UCA1做RNA-RNA pull-down实验，发现ALAS2富集较高，反过来以ALAS2为DNA探针，也发现UCA1-ALAS2 mRNA的相互作用。ALAS2 mRNA与PTBP1的作用也进一步通过RIP和RNA pull down实验验证。
总结： lncRNA作为一个架构RNA与蛋白相互结合,并招募调控靶基因的表达。
6. 在转录水平上分析UCA1受谁调控？
用 JASPAR数据库预测UCA1TSS 2kb内的TF motif，有两个GATA motif在UCA1启动子区域附近，通过ChIP-qPCR验证了GATA1在UCA1启动子GATA motif处的结合。
那么GATA1在这些motif处的占位，是否对UCA1启动子具有调节作用，他们接下来做了luciferase报告实验。且GATA1下调后，UCA1,ALAS2, and PTBP1 的表达也显著下调。因此，他们提出GATA1 在UCA1启动子处有占位，且调节UCA1的表达。
总结： 关注lncRNA的上游分析，在转录水平上受什么调控，通过motif分析，找到lncRNA在promotor处潜在的转录因子结合位点，然后通过ChIP-qPCR，luciferase等实验验证。
总结
这篇文章逻辑清晰，讲了lncRNA(UCA1)通过调节血红素的合成影响红细胞的发育成熟的故事，机制讲得还是比较完整的，将lncRNA作为一个scaffold RNA与PTBP1蛋白形成RNA-蛋白质复合物，并募集到ALAS2调节其表达，同时在转录水平上，UCA1受GATA1的调控促进转录。