title：Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis
journal：cell stem cell
IF: 21.46
摘要：精子发生产生成熟的雄性配子，对遗传信息的跨代的稳定传递时至关重要的。然而，人类生精过程的发育上的宏观特征目前还是未知的。我们使用了单细胞RNAseq的技术检测了来自具有正常生精过程的成年男性的2854个睾丸细胞，以及来自非梗阻性无精症患者的174个睾丸细胞。我们建立了一个分级的模型，在这个模型中我们可以研究三种精原细胞、七种精母细胞和四种精子细胞的渐进式的发育过程。随后的分析中也鉴定出了一些人类生殖细胞的阶段特异性的marker，比如说HMGA1 PIWIL4 TEX29 SCML1 CCDC112等。更重要的是我们也发现了一个NOA病人中睾丸体细胞的改变的基因表达模式（与正常相比），这为雄性不育的诊断提供了依据。我们的工作有助于研究人类生精过程中渐进的细胞命运转化的转录图谱的建立，这可以应用到处理雄性相关的不育性疾病的诊断中。
介绍：精子发生是一个高度有序的能够连续供应精子的过程，其中精原细胞的维持，准备和分化过程，以及随后的减数分裂能力的获得及精子形成的过程是其中至关重要的事件。以前的研究揭示了人类生殖细胞系的转录水平上特征，然而青春期后的睾丸中雄性生殖细胞的发育的宏观特征目前仍然未知。
人类生殖细胞的发育路径图有别于小鼠，比如说人类精原细胞的扩增效率就明显低于其他物种，尽管一些研究已经揭示了人类生殖细胞的一些细胞层面的特征，但是其转录层面和调控网络目前仍然未知。新发展的单细胞测序技术可以帮我们研究这些细胞内的相互作用及细胞之间的异质性，从而解决上述问题。
不孕不育目前发病率为10%-15%，其中男性的因素占50%，然而男性不育的诊断及其中的病因学原理目前仍然缺乏理解，这主要是我们缺乏可以指示患病状态的marker。另外，目前男性精子的体外产生也是跟小鼠一样非常有希望，但是目前稳健的产生雄性配子的方法目前仍然未知。因此人类精子发生的路线图可以提供睾丸生殖细胞的特异性marker，同时也可以提供一些用于诊断男性不育生的marker。
结果：
1、人类睾丸细胞的全转录组模式和细胞身份的确定
雄性成年人的样本来自于两类，一类是正常个体,另一类是OA病人，这两类的捐献者都有正常的生精上皮和成熟的精子。为了捕获成年人睾丸中所有类型的细胞，一般采用两种方法，第一种是随机的细胞挑选（不筛选），另一类是通过FACS进行细胞筛选。总的来说，我们获得了3059个人类睾丸细胞，其中通过质检的有2854个。经统计，我们在每个细胞中平均可检测到7378个基因和122443条mRNA分子。
所有通过质检的2854个细胞最终被聚类为14个连续的簇和3个分离的簇
其中的marker检验如下
SSC：GFRA1 UTF
differentiating spg KIT MKI67
differentiated spg STRA8
leptotene SPO11（减数分裂特异的双链断裂) SYCP1（联会）TEX19（细线期中SPO11以来的减数分裂重组调控子）
zygotene 同上
pachytene OVOL1 OVOL2 （偶线期和粗线期中定位在XY body上的蛋白）
diplotene NME8(从粗线期精母细胞表达直到精子细胞早期阶段) 同上
spc7（diakinesis metaphase anaphase telophase）： 同上
round spermatid TXNDC2（圆形精子和长型精子的marker）TNP1 PRM1（精细胞和精子的marker）
elongated spermatid 同上
sertoli cell AMH SOX9
myoid cell MYH11
lydig cell DLK1
macrophages CD68 CD163
2、精子发生的基因表达和细胞特异性分子的表达模式
使用monocle做了无监督的拟时间分析，获得了人类精子形成过程中从SSC到S4阶段的转录图谱，其中未筛选的结果与筛选后的细胞的拟时间分析图相似。
细胞周期状态的评价是通过分析G1/S和G2/M时期特异的基因来完成的。在SSC中，细胞增值状态相对静止，当SSC进入分化状态后，上述基因被激活，从分化完成的spg到L2时期的细胞，这种基因的表达一直存在，随后在L3时期G1/S阶段特异的基因表达下调，从粗线期到双线期，G2/M阶段特异性的基因表达上升，并最终在SPC7阶段下降。经过第二次细胞分裂后，精子细胞退出细胞周期并进入精子形成过程。与生殖细胞相比，睾丸体细胞具有微弱的增殖活性，基本处于静息状态。同时发现了分化中的精原细胞到偶线期细胞高表达CCND1 CCNE2 CDK4等基因，它们会参与G1/S时期的进程。相反的是,在粗线期到SPC7阶段会高表达G2/M阶段特异的基因CDK1 CCNA1 CCNA2 CCNB1 CCNB2等。
我们发现每一个cluster中都存在很少的特异性表达基因，包括SSC中的HMGA1,分化精原细胞中的PRAME,L1中的SCML1，L2中的DPH7，L3中的DSG3,偶线期中的TDRG1,粗线期中的CCDC112，双线期中的AURKA，SPC7中的C9ORF116,S1中的TEX29,S2中的NFKBIB,S3中的IQCF3,S4中的LELP1等，同时使用RNA原位杂交和免疫染色等方式证明了单细胞得到的结果。
3、人类精原细胞的动态基因表达模式
在结果中，三种精原细胞被确定。对三种细胞的差异基因进行分析，并结合生物学过程进行了解释（略）
一些典型的精原细胞的marker在该数据集中被检查。GFRA1是与精原细胞自我更新相关的，其作用是通过RET通路，另外NANOS2 ZBTB16 SALL4 POU3F UTF1 NANOS3等基因也在SSC的簇中高表达。同时FGFR3 BMPR1B等基因也共表达于该时期。
KIT是一种分化中的A类细胞的marker，高表达于cluster2，同时MKI67也有类似的表达模式，因此该簇为分化中的精原细胞
STRA8开始表达于cluster2，高表达于cluster3 ，因此认为cluster3为分化后的细胞
拟时间分析发现在SSC和分化中的精原细胞或者分化中的精原细胞与分化完成的精原细胞之间没有重叠的亚群，因此认为这之间存在中间转化的状态（重点！！！即划分过于粗犷，大群中有亚群）。经过分析，发现SSC簇中可以继续划分为GFRA高UTF1低亚群和GFRA低UTF1高亚群，其中发现DMRT1高表达于前者的细胞群中，另外在两个亚群的差异基因的筛选中得到了PIWIL4 ASB9 L1TD1等基因
随后使用了免疫染色观察了得到的几个基因在生精细胞中的表达位置，得到结论：FGFR3(high)KIT(low)STRA8（neg）和BMPR1B(pos)KIT(low)STRA8(neg)均属于SSC,而FGFR3(low)KIT（high）和BMPR1B(neg)KIT(high)属于分化中的精原细胞，而FGFR3(neg)STRA8(pos)和BMPR1B（neg）STRA8(pos)属于分化结束的精原细胞
作为SSC与精原细胞之间可能存在独特的细胞周期的证据，我们发现在精原细胞中独特地表达UTF1和MKI67，这说明SSC是睾丸中生殖干细胞自我更新的储池，相反的KIT和MKI67在分化中的精原细胞中存在共定位，说明了分化中的精原细胞存在细胞增殖和细胞分化这两个过程
我们还发现了分化后的精原细胞开始表达进入L1阶段，开始表达减数分裂相关的marker，证明了在分化后的精原细胞中存在有丝分裂向减数分裂的过度阶段。因为这个过程需要RA，因此对RA相关的酶做了分析，发现ALDH1A1和CYP26B1高表达于支持细胞和MIX中，ALDH1A2高表达于粗线期双线期和SPC7中，ALDH1A3高表达于粗线期中
随后作者看了BMP信号通路的关键因子在精原细胞阶段的表达。
4、人类精母细胞的动态基因表达模式
对精母细胞的每个阶段做了差异分析和GO分析，针对分析结果做了解释
其中，我们发现了一些减数分裂重组的基因SPO11，DMC1 RAD51AP2高表达于细线期和偶线期阶段。另外，联会复合体的基因如SYCP3 SYCP1 SYCP2 SYCE1 TEX12等在细线期和偶线期均表达上调，说明这个阶段是为后来的双链DNA断裂，同源染色体配对和联会做准备，在完成了减数分裂的重组过程后，伽马H2AX的积聚在XYbody上发生，与这个现象一致的是OVOL1和OVOL2高表达于粗线期和偶线期阶段。另外CCNA1和CCNA2高表达于粗线期和SPC7阶段
SPC7阶段包含了diakinesis, metaphase, anaphase, telophase, 和 secondary spermatocytes，CCNA1 CCNA2 TJP3 SLC26A3 SIRPG等在该阶段均表达上调。另外ACR（一种顶体蛋白的前体形式）高表达于粗线期到S4阶段，这与之前的报道，顶体蛋白可以在晚细线期到次级卵母细胞中均被检测到。PNA是一种精子顶体的特异性蛋白，起始表达于粗线期。TJP3是高表达于SPC7到S1阶段
组蛋白变体在染色质重组和基因表达调控中起关键作用，我们发现在减数分裂前期聚集了一系列的组蛋白变体（重要！！！），
减数分裂性染色体失活发生在减数分裂前期，伽马H2AX在粗线期时被发现，说明这段时间正在进行MSCI，同时ATR H2AFX BRCA1 MDC1等也是在这个时期表达，另外我们发信啊TOPBP1 REC114 FAAP24和RAD51等也是在粗线期精母细胞中特异性表达上调。我们发现了转录抑制仅仅发生在性染色体上，在粗线期精母细胞中转录水平降到最低，并逐步上调直到SPC7阶段。随后对X和Y染色体的基因根据表达模式分为五个时期，发现21%精原细胞表达的X染色体基因在MSCI结束后重新被激活，73%的基因在S期被抑制，相反的，33%的精原细胞的Y染色体上的基因在MSCI后重新被激活，84%的基因在精子阶段被抑制（重点！！！）
5、人类精子细胞的动态基因表达模式
首先对四个阶段做了差异分析和GO分析，并对注释的结果做了解释
其次是，计算了四个阶段检测到的转录本数量，发现呈现一个递减的趋势，说明在精子形成过程中转录活性在逐渐被抑制，因此对差异基因做了趋势分析，找到了被抑制和被重新激活的基因，并通过GO分析加以解释。第三种模式的基因中呈现先增后降的趋势，GO的注释与微管相关，这与该阶段发生的细胞质的减少有关，在第四种模式中的基因呈现逐渐回升的趋势，GO的注释显示与己糖的生物合成和氯化物的转运相关，被认为是与精子顶体的形成有关。
然后介绍了几个marker基因，其中DDX4在S2时期表达下降，在S3到S4时期消失，同时S1和S2高表达精子特异性的基因如SUN5，在S2到S4时期，也存在SPEM1的高表达。
使用DDX4 TNP1 PRM1 PNA四个基因可以对S1-S3通过免疫荧光进行定位，其中DDX4(+)TNP1(-)PRM1(-)和顶体泡状PNA表示S1阶段，DDX4(+)TNP1(+)PRM1(+)和新月状PNA表示S2阶段，DDX4(-)TNP1(+)PRM1(+)和帽状表示S3阶段，同时也发现S3细胞的直径明显小于S1和S2，DDX4(-)TNP1(-)PRM1(+)表示S4阶段
6、成年人睾丸中的体细胞的转录模式
支持细胞主要表达与固醇生物合成过程和性别决定相关的基因，MIX主要表达细胞黏附和胞外基质形成的基因，巨噬细胞主要表达免疫应答等相关的基因。支持细胞高表达一些分析，比如SPY NA5A1 DMRT1等，另外雄激素受体（AR）高表达在支持细胞和MIX中，而巨噬细胞中表达CD68和CD163以及IL10和CX3CR1
值得注意的是，MIX中包含了PMC和间质细胞这两类细胞
通过免疫染色，我们发现了SOX9特异性表达在支持细胞中，而间质细胞中特异性表达INSL3.
7、人类精子发生过程中的转录因子网络
ARACN算法来分析已知的所有1568个转录因子，以此来找到在每个阶段差异性表达的转录因子。考虑到发育的顺序，人有丝分裂停滞时期的胎儿生殖细胞与成年人的精原细胞是最相似的。因此对该类细胞进行了重新分析，发现富集到一些与氧化还原和凋亡调控相关的基因，而成年男性睾丸中的SSC则伏击到一些有性生殖和受精相关的基因。因此 认为转录因子在胎儿生殖细胞向成年精原细胞的转化中的激活过程具有中关键的作用。
8、人类精子发生的单细胞数据可以作为诊断雄性生殖相关的疾病的参考
9、人类精子发生的单细胞数据可以作为研究人和小鼠精子发生保守型的依据。