人外泌体标志蛋白鉴定

A 目的

鉴定外泌体的纯化

B 材料与方法

a. Western Blot
同Western Blot， 使用还原性LB

b. 流式细胞术
需与磁珠/胶体珠偶联（如Dynabeads^® magnetic beads），其余同流式细胞术

c. 胶体金标记免疫电镜

材料

100,000 × g exosome沉淀
2% or 4% (w/v) PFA
PBS
PBS/50 mM 甘氨酸 或 PBS/50 mM NH4Cl
封闭液: PBS/5% (w/v) BSA, PBS/10% (v/v) FBS, 或 PBS/1% (w/v) 冷鱼皮明胶 (CFG; Sigma Aldrich)
一抗
抗体稀释液
洗液: PBS/0.1% (w/v) BSA, PBS/0.1% (v/v) FBS, 或 PBS/0.1% (w/v) CFG
二抗
PBS/0.5% (w/v) BSA
蛋白A–金偶联物 (Cell Microscopy Center, Utrecht, The Netherlands)
1% 戊二醛
Formvar-carbon载样铜网
封口膜
5号镊子
电镜样品制备材料

方法

将exosome固定在载样铜网上

同电镜样品制备

封闭抗原

1. 将铜网放在PBS上洗2 * 3 min.
2. 将铜网放在PBS/50 mM 甘氨酸 洗 4 * 3 min
   *注：甘氨酸会耗尽游离醛基。 可使用 50 mM NH4Cl替代
3. 将铜网放在封闭液上 10 min

孵育抗体

7. 将铜网放在 5μl 一抗稀释液上 30 min
   注：一抗浓度 2 to 20 μg/ml，需测试
8. 将铜网放在洗液上洗 6 * 3 min
9. (可选): 封闭液中孵育二抗 30 min
10. 将铜网放在100 μl 封闭液中洗6 * 3 min.

标记蛋白A–金偶联物

11. 将铜网放在 5μl 蛋白A–金偶联物（稀释在封闭液中）20 min.
    注：使用Dako二抗时推荐 1:200 的胶体金比例
12. 将铜网放在 100 μl PBS洗8 * 2 min
13. 将铜网放在 50 μl 1% 戊二醛 5 min
14. 将铜网放在 100 μl 双蒸水中洗8 * 2 min

电镜样品准备

同电镜样品准备

Figure 1. exosome免疫电镜

C 鉴定外泌体的最低标准

至少三种蛋白存在（Table 1 第1,2 组，经典蛋白见Figure 1），Table1 第3组蛋白不存在。透射电镜/原子力显微镜观察形态，测量大小。

Table 1. Different categories of proteins and their expected presence in EV isolates, including some examples (non-exclusive)

1. Transmembrane or lipid-bound extracellular proteins	2. Cytosolic proteins	3. Intracellular proteins	4. Extracellular proteins
验证膜结构的存在 在EVs/exosome中富集	具有膜/受体结合能力 在EVs/exosome中富集	在膜结构/内含体中不存在的蛋白 在exosome中不存在/低表达，在一些类型的EVs中表达	特异/非特异性地与膜结构结合，与exosome一起分离出来 与exosome的关系多样
1. Tetraspanins (CD9, CD63, CD81)  2. Integrins (ITG or cell adhesion molecules (CAM) 3. Growth factor receptors 4. Heterotrimeric G proteins (GNA) 5. Phosphatidylserine-binding MFGE8/lactadherin	1. Endosome or membrane-binding proteins (TSG101, annexins, Rabs) 2. Signal transduction or scaffolding proteins (syntenin)	1. Endoplasmic reticulum (Grp94, calnexin) 2. Golgi (GM130) 3. Mitochondria (cytochrome C) 4. Nucleus (histones) 5. Argonaute/RISC complex (AGO)	1. Acetylcholinesterase (ACHE) 2. Serum albumin 3. Extracellular matrix (fibronectin, collagen) 4. Soluble secreted proteins (cytokines, growth factors, matrix metalloproteinases)
至少存在一种	至少存在一种	不存在	非必须

Figure 2. 常用外泌体marker