2020-02-03 Single-cell RNA-seq enables comprehensive tumour and immune cell profiling in primary ...

---

title: 单细胞转录组分析在初级卵巢癌中肿瘤和免疫细胞的转录组状态
期刊：nature communication

---

Abstract
离体的肿瘤组织的单细胞转录组模式包含了异质性的肿瘤细胞以及周围间质细胞和免疫细胞的特征。在这里，我们将这种方法应用到乳腺癌样本中，并分析了来自于11个细胞的515个肿瘤细胞。从单细胞转录组数据中推测的拷贝数变异可以将肿瘤细胞和非肿瘤细胞加以区分。在单细胞的尺度上，肿瘤细胞呈现一些共有特征，包括肿瘤和瘤内异质性，这些异质性于乳腺癌亚型和关键的癌症相关通路有关。大多数的非肿瘤细胞是免疫细胞，有三类分别为T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。T淋巴细胞和巨噬细胞呈现免疫抑制性，T细胞呈现一种调控或增强的表型而巨噬细胞呈现一种M2表型。这些结果表明，乳腺癌中的转录组由更大的瘤内异质性，这是由肿瘤细胞和周围微环境的免疫细胞共同塑造的。
Introduction
很多针对乳腺癌的分子靶向治疗的方法被评估，因为内分泌疗法在治疗雌激素受体阳性的肿瘤类型中的应用。对于靶向人表皮生长因子受体2的扩增的乳腺癌的基因组改变匹配的治疗方式是成功使用基因靶向治疗的例子。基因表达为基础的分子亚型也被广泛应用到乳腺癌的应急治疗中。分子靶向的想法已经越来越多地应用到乳腺癌的治疗中并由很好的治疗结果。然而，基因组和基因表达的模式被用来描述bulk肿瘤的情况，而肿瘤呈现出瘤内异质性，这很有可能会影响靶向治疗的治疗效果。
乳腺癌中遗传的异质性已经高水平的基因组覆盖的单细胞技术被证明了，而拷贝数变异是癌症发展的早期阶段的一个特征，并能稳定保持，而单核苷酸的改变却随着肿瘤进化而发生显著变化。最近的一项关于基因组变异的研究证明了在单个肿瘤中存在多种驱动力，这说明遗传的异质性对于治疗效果有直接的影响。同时基因表达水平的异质性也会极大的影响病人的临床治疗效果。大概20%的ER阳性的肿瘤患者对内分泌治疗有抗性或在后期阶段产生抗性。在ER阳性的肿瘤中出现的ER阴性的细胞可能是产生抗药性的罪魁祸首。通过其它生长因子受体的相关信号通路的激活可能也会产生基因表达的异质性。
在bulk肿瘤中的基因表达模式反映了非肿瘤compartment的特征，例如乳腺癌中，这种特征是很多基质细胞、免疫细胞和内皮细胞混在一起共同作用的结果。这些混合细胞形成肿瘤的微环境并在肿瘤的起始发展和治疗抗药性过程中起重要的作用。微环境基因表达的特征可能具有独立于肿瘤亚型的特殊的预后价值。形成肿瘤微环境的主要细胞类群包括肿瘤相关的纤维细胞和免疫细胞。免疫细胞类群是由多种分担不同角色的免疫细胞组成的混合类群。肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）经常可以促进肿瘤的进展和转移，而CD8阳性的细胞毒T细胞和CD4阳性的Th1细胞可以引起抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤生长。进一步讲，调控型T细胞或耗竭表型（？）的T细胞与抗肿瘤免疫的失败相关。B细胞的一个小亚群可以促进肿瘤的进展，通过影响不同的细胞类型的功能来实现的。然而，B细胞在肿瘤中的大量出现往往预示着良好的预后。同时，肿瘤微环境可以通过这些变化的细胞组分的相互作用以及与肿瘤细胞的交流来形成。
单细胞基因组分析在肿瘤治疗中有很好的应用前景。循环肿瘤细胞的非浸润监视、肿瘤异质性评估、复发肿瘤的早期检测以及稀有细胞类群的敏感监视可以用来治疗顽固肿瘤。弄清楚实体肿瘤中的异质性、肿瘤的精确特性及微环境的基因表达情况可以帮助我们更好地进行分子靶向治疗。异质性肿瘤的特征可以帮助我们选择有效的分子治疗手段，而肿瘤相关的免疫细胞的特征可以揭示更好的治疗策略来克服免疫抑制并恢复正常的免疫监督。
我们提供了不同亚型的11个病人的515个单细胞的转录图谱。来自单个肿瘤组织的单细胞包含了肿瘤细胞和非肿瘤细胞。每个群体有不同的基因表达模式，这些特征是无法在一个混合的细胞群中看到的。总之，我们的研究揭示了由微环境中肿瘤细胞和免疫细胞共同塑造的不同肿瘤亚型的特征。
Result
1、11个病人的基因组特征及单细胞分析结果
我们选择了11个代表四种乳腺癌亚型的病人：luminalA，luminalB，HER2和TNBC。除了一例以外的其它所有的样本都来自于未经过化疗的病人，并且使用了各个亚型的marker做了病理学检查：ER阳性（BC01 and BC02; luminal A），ER/HER2阳性（(BC03; luminalB），HER2阳性（BC04, BC05 and BC06; HER2）和三阴性浸润性导管癌（BC07–BC11; TNBC）。区域性的淋巴结转移的样本来自于luminalB样本（BC03LN）和三阴性乳腺癌样本（BC07LN）
全外显子测序揭示了这些样本相关的体细胞突变的和拷贝数变异等相关的基因组特征。三阴性乳腺癌病人显示出CNA的明显改变，这与之前说的该种亚型的肿瘤存在明显的基因组不稳定的特征是一致的。我们也证明了在乳腺癌中基因组的变异，包括PIK3CA的缺失突变或扩增，TP53的缺失突变和删除以及ERBB2的扩增等。
我们在未经提前sort的情况下使用微流体芯片分离获得单细胞并测序，最终获得每个细胞5.8million条read的数据集。两个spiked--inRNA的固定比例的检测确保了实验的质量和一致性。24个挑选出来的基因的定量PCR的表达分析支持的单细胞RNA测序的数据。单细胞样品的基因表达的均值和pooled样本的比较部分证明了相关性。额，全是一些质控环节。。。总之，单细胞转录组可以很大程度上描述一个实体肿瘤，但是肿瘤的成分在单细胞分离和测序的过程中被丢失。
2、肿瘤和肿瘤相关的正常细胞的分离（算法？？？）
我们分析了515个肿瘤细胞的基因表达模式，发现存在广泛的瘤内异质性，正如病人本身和病人之间的数据做出的PCA图那样显示的。治疗靶点的表达情况比如ESR1和ERBB2等基因也在瘤内及瘤间存在多样性。因为我们的样本未经预先筛选，因此我们推测非肿瘤细胞可能会对我们看到的瘤内异质性有所贡献。这些非肿瘤细胞根据组织病理学检测可以判断是一些纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞和各种免疫细胞。每个被证明有不同程度的免疫细胞浸润的肿瘤如luminalA类型的都是高度富集了肿瘤细胞，而大多数TNBC类型的肿瘤细胞显示出广泛的免疫细胞浸润。
肿瘤组织的基因表达模式反映了肿瘤和周围微环境的特征。因此，单细胞转录可以将肿瘤特异性的基因表达从非肿瘤群体中分离出来。我们使用染色体基因表达模式来分离乳腺癌细胞。这里基因表达模式对应的是染色体的moving average（？？？）。使用了这个方法，肿瘤细胞可以有明显的染色体基因表达模式，概括了肿瘤特异性的CNV..非监督水平层次聚类可以确定11cluster：病人特异性的肿瘤簇，包含了不同的染色质基因表达模式，以及一个多病人的非肿瘤细胞簇，这个细胞簇没有显著性的CNV的变化。染色质基因表达模式高度概括了基因组CNV的模式。肿瘤和非肿瘤的分离可以通过非监督的PCA分析进行证明。
为了进一步描述肿瘤和非肿瘤细胞的特征，我们分析了肿瘤相关的基质细胞和免疫基因集的表达情况，具体方法参照参考文献26（有趣！）。大多数的非肿瘤细胞具有较高的免疫特征的打分。大量的有低免疫分数的非肿瘤细胞表达基质细胞基因，这说明它们是肿瘤相关的纤维母细胞。大多数肿瘤细胞在基质和免疫细胞的分数上都很低，同时表达高水平的表皮细胞分化的marker。总之，通过515个单细胞的分析，我们获得了317个表皮乳腺癌细胞、175个肿瘤相关的免疫细胞和23个非肿瘤的基质细胞。
3、在肿瘤侵袭中固有肿瘤细胞的异质性（算法？？？）
515个细胞的基因表达的细胞细胞的相关性分析证明了同一个病人的细胞之间相对低的相似性。在排除了198个非肿瘤细胞后，我们发现在一个病人中的单个肿瘤细胞之间的相关性显著上升，这说明肿瘤中固有的性质和异质性可以通过单细胞的水平显现。来自TNBC亚型的肿瘤细胞在去除或不去除非肿瘤细胞的时候趋向于展示低的细胞-细胞相关性，这说明在TNBC中，肿瘤固有属性和微环境属性对于瘤内异质性的贡献。最终，单细胞分析揭示了每个病人肿瘤组织不同的肿瘤特征和不同的微环境特征。
假定的肿瘤细胞被进一步分成不同的分子亚群，通过ER和HER2module分数的联合分布（？？？）。为了分析分子亚群，我们排除了BC05肿瘤细胞，因为它接受了新型的化疗和抗体治疗。这个分类方法对于TCGA数据库中的数据预测准确率搞到91%。大多数肿瘤细胞被定义为bulk肿瘤的相对的亚型条目中，而一些肿瘤显示出混合亚群的细胞。特别地，从HER2阳性的肿瘤中获得的细胞，有最强的亚型多变性，从HER2到TNBC。Carcinoma cells from the ER/HER2 double-positive tumour (BC03) were categorized as the ER subtype with concomitant but low expression of HER2 module genes.
肿瘤细胞多表现出侵袭性的肿瘤特征，比如外胚层-中胚层转化（EMT），干细胞特性，血管再生、增殖以及复发等。总之，TNBC型的肿瘤细胞有EMT特征的更高的表达水平。HER2和TNBC有干细胞特性和复发性的更高水平的特征，值得注意的是，EMT、干性和血管再生有很高的正相关性，而很少的带有高复发性的细胞被鉴定到。这些稀有的细胞群，可能对于肿瘤的进展和转移起重要的作用。
4、在乳腺癌亚型中异质性的构成
在去掉非肿瘤细胞后，大多数肿瘤细胞有与亲代群体一致的基因表达特点。使用单细胞数据集，我们将不同亚群的乳腺癌细胞的差异表达基因找出。我们应用Seurat并使用似然比检验（LRT）方法来提取了不同亚型的差异基因。大多数的luminal肿瘤细胞高表达ER和经典ER通路的基因。
略
5、肿瘤浸润的免疫细胞的异质性
略

Discussion
略