转录组（5）：序列比对

参考http://www.jianshu.com/p/681e02e7f9af
http://www.jianshu.com/p/93f96e7538da
任务：

1. 比对软件很多，首先大家去收集一下，因为我们是带大家入门，请统一用hisat2，并且搞懂它的用法。
2. 直接去hisat2的主页下载index文件即可，然后把fastq格式的reads比对上去得到sam文件。
3. 接着用samtools把它转为bam文件，并且排序(注意N和P两种排序区别)索引好，载入IGV，再截图几个基因看看！
4. 顺便对bam文件进行简单QC，参考直播我的基因组系列。

1. 比对软件

• HISAT2：http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml
  参考资料：http://blog.biochen.com/archives/337
• STAR：https://codeload.github.com/alexdobin/STAR/zip/master
  参考资料：http://www.bio-info-trainee.com/727.html
• TopHat：http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
  参考资料：http://blog.sina.com.cn/s/blog_8808cae20101amqp.html
• RapMap：https://github.com/COMBINE-lab/RapMap
  参考文献:https://academic.oup.com/bioinformatics/article/32/12/i192/2288985/RapMap-a-rapid-sensitive-and-accurate-tool-for
• CIDANE：http://ccb.jhu.edu/software/cidane/
  参考文献：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-015-0865-0
• CLASS2 ：https://sourceforge.net/projects/splicebox/files/?source=navbar
  参考文献：https://academic.oup.com/nar/article/44/10/e98/2516329/CLASS2-accurate-and-efficient-splice-variant

2. HISAT2的使用

为什么要用index？官网有描述：为了用整个index代表整个基因组，HISAT2 用小的index覆盖了整个基因组，每个index覆盖了56 Kbp的范围，覆盖整个人类基因组需要55,000 indexes，这些index结合其他策略可以快速准确的比对序列。

#index 下载
nohup wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/hg19.tar.gz &
tar -zxvf *.tar.gz #解压
# 删除压缩包
rm -rf *.tar.gz

• hisat2 -h查看帮助文件：

Usage: 
  hisat [options]* -x  {-1  -2  | -U  | --sra-acc } [-S ]

    Index filename prefix (minus trailing .X.ht2).
         Files with #1 mates, paired with files in .
             Could be gzip'ed (extension: .gz) or bzip2'ed (extension: .bz2).
         Files with #2 mates, paired with files in .
             Could be gzip'ed (extension: .gz) or bzip2'ed (extension: .bz2).
          Files with unpaired reads.
             Could be gzip'ed (extension: .gz) or bzip2'ed (extension: .bz2).
          Comma-separated list of SRA accession numbers, e.g. --sra-acc SRR353653,SRR353654.
        File for SAM output (default: stdout)

  , ,  can be comma-separated lists (no whitespace) and can be  specified many times.  E.g. '-U file1.fq,file2.fq -U file3.fq'.

• 参数说明：

-x 指定index文件名
-1 双端测序第一个文件
-2 双端测序第二个文件
-U 单端测序文件
--sra-acc 登录号
-S 输出文件为sam格式
-q 输入文件为FASTQ .fq/.fastq格式

-比对到参考基因组,RNA-Seq数据是从 SRR3589957 ~ SRR3589962，6个样本的PE数据，也就是有6次循环，可以写脚本，也可以直接在命令行里运行

for i in `seq 56 62`
do
    hisat2 -t -x /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/annotation/hg19/genome -1 /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/SRR35899${i}.sra_1.fastq.gz -2 /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/SRR35899${i}.sra_2.fastq.gz -S /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR35899${i}.sam &
done

运行时间如下：

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• 很耗CPU啊！用的服务器！

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• 结果：

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SAM（sequence Alignment/mapping)数据格式是目前高通量测序中存放比对数据的标准格式，当然他可以用于存放未比对的数据。目前处理SAM格式的工具主要是SAMTools。samtools功能众多，在本次作业中，我们主要学会将sam文件转换为bam文件，并对bam文件进行sorted（其中有两种排序方式N和P），最后建立索引。

Program: samtools (Tools for alignments in the SAM format)
Version: 1.3.1-58-gcbee45e (using htslib 1.3.2-228-g0c32631)

Usage:   samtools  [options]

Commands:
  -- Indexing
     dict           create a sequence dictionary file
     faidx          index/extract FASTA
     index          index alignment

  -- Editing
     calmd          recalculate MD/NM tags and '=' bases
     fixmate        fix mate information
     reheader       replace BAM header
     rmdup          remove PCR duplicates #移除PCR产生的重复序列
     targetcut      cut fosmid regions (for fosmid pool only)
     addreplacerg   adds or replaces RG tags

  -- File operations
     collate        shuffle and group alignments by name
     cat            concatenate BAMs
     merge          merge sorted alignments
     mpileup        multi-way pileup
     sort           sort alignment file
     split          splits a file by read group
     quickcheck     quickly check if SAM/BAM/CRAM file appears intact
     fastq          converts a BAM to a FASTQ #格式转换
     fasta          converts a BAM to a FASTA

  -- Statistics
     bedcov         read depth per BED region #bed文件的测序深度
     depth          compute the depth 
     flagstat       simple stats
     idxstats       BAM index stats
     phase          phase heterozygotes
     stats          generate stats (former bamcheck)

  -- Viewing
     flags          explain BAM flags
     tview          text alignment viewer
     view           SAM<->BAM<->CRAM conversion
     depad          convert padded BAM to unpadded BAM

主要功能：
view: BAM-SAM/SAM-BAM 转换和提取部分比对
sort: 比对排序
merge: 聚合多个排序比对
index: 索引排序比对
faidx: 建立FASTA索引，提取部分序列
tview: 文本格式查看序列
pileup: 产生基于位置的结果和 consensus/indel calling

# 首先将比对后的sam文件转换成bam文件
# 利用的是samtools的view选项，参数-S 输入sam文件；参数-b 指定输出的文件为bam；最后重定向写入bam文件
$ for ((i=56;i<=62;i++));do samtools view -S /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR35899${i}.sam -b > /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR35899${i}.bam;done
# 将所有的bam文件进行排序
$ nohup for (( i=58;i<=62;i++ )); do samtools sort /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR35899${i}.bam -o /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR35899${i}.sorted.bam;done
# 将所有的排序文件建立索引，索引文件.bai后缀
$ for ((i=56;i<=62;i++));do samtools index /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR35899${i}.sorted.bam;done

合在一块跑：
for i in `seq 56 58`
do
    samtools view -S SRR35899${i}.sam -b > SRR35899${i}.bam
    samtools sort SRR35899${i}.bam -o SRR35899${i}_sorted.bam
    samtools index SRR35899${i}_sorted.bam
done

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比对质控(QC)

常用工具有

• Picard https://broadinstitute.github.io/picard/
• RSeQC http://rseqc.sourceforge.net/
• Qualimap http://qualimap.bioinfo.cipf.es/

java -jar /opt/NfsDir/BioDir/picard-tools-1.119/picard.jar CollectMultipleMetrics \
      I=/opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR3589956.sorted.bam \
      O=/opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/multiple_metrics \
      R=/opt/NfsDir/PublicDir/reference/ucsc.hg19.fasta 

统计bam文件：

/opt/NfsDir/BioDir/RSeQC/RSeQC-2.6.4/scripts/bam_stat.py -i /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR3589956.sorted.bam

提示出错：

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检查发现是路径和名称写错了,修改后就可以了
对bam文件进行统计分析

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#下载hg19_RefSeq.bed文件
https://sourceforge.net/projects/rseqc/files/BED/Human_Homo_sapiens/hg19_RefSeq.bed.gz/download
#查看基因组覆盖率
/opt/NfsDir/BioDir/RSeQC/RSeQC-2.6.4/scripts/read_distribution.py -i /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/RNAseq/align/SRR3589956.sorted.bam -r /opt/NfsDir/UserDir/qin/qin/Data/annotation/hg19/hg19_RefSeq.bed

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