Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome impairs erectile function through increased endothelial dysfunction, oxidative stress, apoptosis, and corporal fibrosis in a rat
Y. Hu, X. Niu, G. Wang, J. Huang, M. Liu and B. Peng
Department of Urology, Shanghai Tenth People’s Hospital Affiliated to the Tongji University, Shanghai, China
慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征会通过增加大鼠模型中的内皮功能障碍、氧化应激、细胞凋亡和体质纤维化而损害勃起功能。
IF因子：3.07
PMID：27565759
期刊：Andrology
作者：Hu Y
发表时间：2016-11
慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征 (CP/CPPS) 是勃起功能障碍 (ED) 发生的独立危险因素。但是 CP/CPPS 和 ED 之间关系的分子机制仍不清楚。本研究的目的是研究 CP/CPPS 对大鼠模型勃起功能的影响及其可能的机制。建立实验性自身免疫性前列腺炎 (EAP) 大鼠模型，模拟人 cpps。然后将 20 只 2 月龄雄性 Sprague-Dawley 大鼠分为 EAP 组和对照组。在海绵体神经电刺激过程中测量海绵体内压 (ICP) 和平均动脉压 (MAP)，计算最大 ICP/MAP 比值。采血测定血清 C 反应蛋白 (CRP) 、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、 interleukin-1 β (IL-1 β) 、 interleukin-6 (IL-6) 水平。和睾酮，分别。检测阴茎海绵体内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 、环磷酸鸟苷 (cGMP) 水平、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性和丙二醛 (MDA) 水平的表达。我们还评估了平滑肌/胶原比率和凋亡指数 (AI)。EAP 组最大 ICP/MAP 比值明显低于对照组。EAP 组血清 CRP 、 TNF-α 、 IL-1 β 和 IL-6 水平均明显高于对照组。EAP 大鼠阴茎海绵体中 eNOS 和 cGMP 的表达水平明显下调。此外，EAP 大鼠阴茎海绵体中 SOD 活性和平滑肌/胶原比降低，MDA 水平和 AI 增加。总之，CP/CPPS 损害了大鼠模型的阴茎勃起功能。阴茎海绵体 eNOS 表达和 cGMP 水平的下降可能是 CP/CPPS 诱导 ED 的重要机制。CP/CPPS 还增加了大鼠阴茎海绵体中的氧化应激、细胞凋亡和平滑肌/胶原比，这些对勃起功能都很重要。
引言
前列腺炎是一个非常常见的泌尿科问题，其症状复杂，严重影响患者的生活质量（Rees等人，2015）。 根据美国国立卫生研究院（NIH）的研究，前列腺炎分为四类，急性细菌性前列腺炎（I类）、慢性细菌性前列腺炎（II类）、慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP / CPPS，III类） 和无症状性炎症性前列腺炎（IV类）（Krieger等，1999）。 CP / CPPS的特点是疼痛或不适位于骨盆和生殖器，以及在没有尿路感染的情况下出现下尿路症状（LUTS）（Tran＆Shoskes，2013）。 通过NIH慢性前列腺炎症状指数（CPSI）评分评估的CP / CPPS患病率在中国男性中约为8.4％（Liang et al，2009）。
勃起功能障碍（ED）的定义是持续无法获得和维持足以使性行为令人满意的勃起功能（Hatzimouratidis等，2010）。它也是一种常见的性功能障碍，主要影响40岁以上的男性（Shamloul＆Ghanem，2013）。在40至49岁的男性中，ED的患病率为3％至15％，而在70岁以上的男性中，ED的患病率为53％至98％（Pinnock等，1999； Braun等）等人，2000； Hao等人，2011； Song等人，2014）。但是，CP / CPPS和ED之间的关系经常被忽略。流行病学研究表明，与正常人群相比，患有CP / CPPS的男性似乎更容易出现勃起功能障碍（Li＆Kang，2016）。例如，郝等人（2011年）报道，使用国际勃起功能指数5（IIEF-5）评分评估，慢性前列腺炎男性的ED患病率（35.1％）比普通人群（17.1％）高。但是，CP / CPPS和ED之间的具体机制仍不清楚。这项研究的目的是研究CP / CPPS对大鼠模型勃起功能的影响及其可能的机制。可靠的人类疾病实验动物模型对于发现发病机理和治疗策略很重要。 CP⁄CPPS的发病机理仍知之甚少，但越来越多的证据支持自身免疫因子已成为主要成分（Zhang等，2011）。实验性自身免疫性前列腺炎（EAP）的大鼠模型被认为是适用于人CP⁄CPPS的模型，该模型基于先前描述的方法（Motrich等，2007； Wang等，2015a，b）。 EAP大鼠的特征是与炎症细胞的渗透有关的前列腺特异性自身免疫反应，并且与人CP⁄CPPS具有许多临床，病理学特征（Vykhovanets等，2007； Penna等，2009）。我们首先建立了EAP大鼠模型，然后比较了EAP大鼠和正常对照组的勃起功能。我们的研究可以为人CP / CPPS联合ED提供新的治疗策略。
材料和方法
大鼠CP / CPPS的诱导
从上海斯拉克实验动物有限公司（中国上海）获得了30只2个月大的Sprague–Dawley雄性大鼠（180–220 g）。十只大鼠用于制备自体前列腺组织匀浆上清液（PTHS）。其余20只大鼠随机分为EAP模型组和对照组（每组10只）。在EAP模型组中，通过多点皮下注射向每只大鼠注射1.0 mL PTHS的等体积混合物（20 mg / mL）和弗氏完全佐剂（FCA）。同时，腹膜内注射0.5mL百日咳-白喉-破伤风疫苗。在对照组中，每只大鼠注射等体积PBS。在第0、15和30天进行了3次免疫接种后，建立了EAP大鼠模型。本研究的所有程序均按照上海市第十人民医院动物实验委员会的指导方针和道德标准执行。
勃起功能评估
使用最大海绵体内压力（ICP）和最大ICP /平均全身动脉压之比（MAP）评估勃起功能，这已在之前进行了描述（Chen等，1992； Cashen等，2002）。通过电刺激海绵状神经引起勃起反应，并在第45天进行最大ICP的测量和最大ICP / MAP比的计算。用腹膜内戊巴比妥钠（40 mg / kg；中国国药集团化学试剂有限公司，上海）麻醉大鼠。使用Windows计算机程序控制的多通道生理记录仪测量和记录压力，并使用BL-420V压力传感器系统（成都，中国成都）进行分析。对于每只大鼠，以12 Hz的频率和5毫秒的脉冲宽度刺激海绵神经的电刺激。在5 V下一式三份地进行刺激30秒钟，随后的刺激间隔为5分钟。平均最大ICP / MAP值被认为代表大鼠的勃起功能。
血清中炎性细胞因子和睾丸激素水平的测定
评估勃起功能后，从鼠尾静脉收集血液样本，并将血清样本保存在80°C直至进行分析。使用酶联免疫吸附测定法测量C反应蛋白（CRP），肿瘤坏死因子-a（TNF-a），白细胞介素1b（IL1b），白细胞介素6（IL-6）和睾丸激素的循环水平试剂盒（ELISA，USCN，中国武汉）根据制造商的介绍。所有实验进行了三次。
组织病理学检查
在评估勃起功能后，使用腹膜内戊巴比妥钠（150 mg / kg；国药集团化学试剂有限公司）对大鼠实施安乐死。快速去除阴茎和前列腺组织并仔细清洁。将海绵体和前列腺组织的一部分固定在4％多聚甲醛中过夜，其余的则存储在液氮中以进行进一步分析。然后将固定的组织在70％的酒精中脱水并包埋在石蜡中。将这些石蜡包埋的标本切成薄片，然后进行去石蜡和补液。如前所述（El-Sakka等，1998），使用Masson的三色染色法评估海绵体中平滑肌和胶原蛋白之间的比例。在制造商介绍之后，用Masson的三色染色试剂盒（Dako Sciences，Glostrup，丹麦）对玻片进行了染色。最后，平滑肌染成红色，胶原蛋白染成蓝色。使用IMAGE PRO PLUS 6.0软件（Media Cybernetics，Inc.，Bethesda，MD，USA）分析平滑肌和胶原蛋白区域。
蛋白质印迹分析
用蛋白质印迹法检测海绵体中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的蛋白表达。将大鼠的阴茎组织在RIPA裂解缓冲液（Beyotime生物技术研究所，中国上海）中匀浆，并在4°C下以12000 g离心15分钟后收集上清液。通过使用BCA蛋白质测定试剂盒（Beyotime生物技术研究所）测定蛋白质浓度。通过使用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后将其转移到硝酸纤维素膜上，在室温下用5％牛奶将其封闭1 h，然后与兔eNOS抗体一起孵育（Cell Signaling Technology，Inc （美国麻萨诸塞州波士顿））。在含0.1％吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水中洗涤3次10分钟后，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的兔抗体（Boster，武汉，中国）在黑暗中孵育1小时。通过使用增强的化学发光（ECL）系统（Beyotime生物技术研究所）检测放射蛋白带。结果通过光密度测定法定量，GAPDH用作内部参考以对数据进行标准化。
RNA分离和定量实时PCR测定
根据制造商的说明，使用Trizol分离试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）从阴茎组织中提取总RNA。使用逆转录试剂盒（Takara，日本）将mRNA反转录为cDNA。实时定量PCR（qRT-PCR）使用SYBR Green PCR Kit（日本Takara）在ABI 7500快速实时PCR系统上按照制造商提供的协议进行。 b-肌动蛋白用作eNOS表达标准化和定量的内部对照。所有实验均独立进行三次。使用 2-**Ct方法计算基因的相对表达。
凋亡评估
根据制造商的说明书（德国曼海姆罗氏应用科学公司）进行了末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP缺口标记试验（TUNEL）以评估细胞凋亡。 TUNEL阳性细胞的数量表示为细胞总数的百分比，并报告为凋亡指数（AI）。
海绵体中环状鸟苷单磷酸（cGMP）水平的测量
使用商业cGMP ELISA试剂盒（美国明尼苏达州明尼阿波利斯市R＆D Systems，Inc.），按照制造商提供的协议评估海绵体组织中cGMP的水平。
海绵体中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平的测量
SOD活性和MDA水平用于评估氧化应激状态。按照制造商的说明，使用商业试剂盒（南京建城生物工程公司，南京，中国）测量海绵体中的SOD活性和MDA水平。
统计分析
所有统计分析均使用SPSS 18.0（SPSS，Inc，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行。数据表示为平均SD。使用未配对的学生t检验分析组之间的差异。 p <0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
EAP大鼠前列腺组织的组织病理学特征
如图1所示，在EAP大鼠中，在前列腺中可以观察到不均匀的组织增生和导管扩张或损伤。慢性炎症细胞的渗透破坏了部分基底层。在对照组的大鼠中，前列腺腺的腺上皮结构完整而清晰，没有炎症细胞浸润和组织增生。在我们的研究中，前列腺组织的组织病理学特征符合关于模拟人CP / CPPS的实验性前列腺炎大鼠模型的诊断标准（Wang等人，2015a，b）。
CP / CPPS对大鼠勃起功能的影响
EAP大鼠和对照组之间的总体重没有统计学上的显着差异（p = 0.192）。与对照组相比，EAP组的最大ICP / MAP比值显着降低（p = 0.013），与对照组相比，EAP组的最大ICP / MAP比值显着更高（p = 0.036），而MAP没有显着差异两组之间的差异（p = 0.412）（表1）。
大鼠血清炎性细胞因子和睾丸激素水平
EAP大鼠的血清CRP，TNF-a，IL-1b和IL-6的水平均显着高于对照组。但是，EAP组和对照组之间的平均睾丸激素水平没有显着差异（表2）。
CP / CPPS对海绵体平滑肌/胶原比例的影响马森三色显示，与对照组相比，EAP大鼠海绵体组织中平滑肌与胶原蛋白的比例显着降低（p ＝ 0.015）。马森三色染色的代表性图像如图2所示。
海绵体中eNOS mRNA和蛋白的表达水平如图3所示，与对照组相比，EAP大鼠海绵体组织中eNOS mRNA的表达水平显着降低（p = 0.032）。与对照组相比，EAP组中eNOS蛋白的表达水平也显着降低（p = 0.028）。
CP / CPPS对海绵体cGMP水平，SOD活性和MDA水平的影响如表3所示，与对照组相比，EAP大鼠海绵体cGMP水平显着降低（p = 0.025）。与对照组相比，EAP大鼠海绵体中的SOD活性显着降低（p = 0.012），与对照组相比，EAP大鼠海绵体中的MDA水平显着增加（p = 0.009）。
CP / CPPS对海绵体凋亡的影响EAP组显示海绵体平均凋亡指数高于对照组（p = 0.034），这是通过TUNEL分析检测到的。代表性图片如图4所示。
讨论
在这项研究中，我们成功建立了模拟人CP⁄CPPS的实验性自身免疫性前列腺炎的大鼠模型。最大ICP与平均MAP的比值被认为代表大鼠的勃起功能，我们的结果表明CP / CPPS损害了勃起功能。 EAP大鼠的血清炎性细胞因子水平（CRP，TNF-α，IL-1b和IL-6）显着升高。与正常对照组相比，EAP组海绵体平滑肌/胶原蛋白比率显着下降。此外，作为勃起相关指标的eNOS和cGMP的表达水平在EAP大鼠的海绵体中显着降低。与正常对照组相比，EAP大鼠海绵体中SOD活性降低，MDA水平升高和凋亡指数升高。我们的结果表明，CP / CPPS诱导的ED大鼠模型与海绵体中eNOS和cGMP表达水平降低，平滑肌/胶原蛋白比例降低以及细胞凋亡和氧化应激状态增加有关。几项流行病学研究清楚地表明，CP / CPPS是ED的重要独立危险因素（Magri等，2008； Chung等，2011，2012； Hao等，2011； Sonmez等，2011； Cantoro等人，2013年； Zhao等人，2014年），但其潜在机制仍不清楚。勃起机制被描述为一种生物心理过程，主要取决于心理，内分泌，血管和神经系统的协调（Jabaloyas，2010）。 eNOS从海绵状内皮细胞合成和释放的NO是阴茎勃起的重要因素（Prieto，2008）。病例对照研究表明，患有CP / CPPS的男性有以下证据：增加了动脉僵硬度和血管内皮功能障碍（Shoskes等，2011）。海绵体组织的内皮功能障碍与NO产生减少和NO活性受损有关，可能导致ED（Zuo等，2011; Pomeshkin等，2013; Bertoluci等，2015; Pan等。，2016）。 cGMP被认为是阴茎勃起的重要组成部分，与NO生成呈正相关（Zhang等人，2016）。在这项研究中，与正常对照组相比，EAP大鼠中cGMP和eNOS的表达水平均显着下降，这表明CP / CPPS通过eNOS / NO / cGMP信号传导途径损害了内皮功能。炎症在ED中起重要的病理生理作用。通过增加炎性细胞因子和细胞粘附分子的产生，功能失调的内皮促进了血管壁内的炎症，并导致了阴茎脉管系统的动脉粥样硬化病变（Vlachopoulos等，2015）。事实证明，与没有ED的男性相比，患有ED的男性的炎症激活增加（Vlachopoulos等，2006）。 CRP，TNF-a，IL-1b和IL-6都是重要的细胞因子和炎症标记物，可抑制内皮细胞中eNOS的表达并降低其生物学活性（Venugopal等，2002; Carneiro等。 （2009年； von Scholten等人，2016年）。在这项研究中，EAP大鼠的血清CRP，TNF-a，IL1b和IL-6水平均显着升高。这表明CP / CPPS会在大鼠体内产生全身性炎症反应，并损害海绵体的内皮功能。
尽管尚未确定CP / CPPS诱导的ED的确切病理生理，但已在大鼠和人类中观察到CP / CPPS与氧化应激之间的关联，并且广泛认为氧化应激和炎性细胞因子参与了C / CPPS诱导的ED的病理过程。 CP / CPPS和症状加重（Kim等，2009； Lan等，2011）。许多神经元和内皮损伤都归因于氧化应激（Jeremy等，2007）。先前的几项研究表明，过氧化物的过量产生可导致活性氧（ROS）在ED的发病过程中发挥重要作用，从而导致阴茎松弛和阴茎海绵体的长期血管病变的急性损害（Jeremy等，2007；Kassan等人，2013； Muniz等人，2015）。阴茎组织中氧化应激导致的体细胞凋亡是勃起功能障碍的主要原因（Ha等，2012）。据我们所知，氧化应激和细胞凋亡都诱导海绵体组织中的平滑肌细胞和内皮细胞损伤。在这项研究中，我们通过测量海绵体中的SOD活性和MDA水平来研究氧化应激，SOD代表细胞对超氧化物的主要防御能力，并且MDA是许多可引起细胞毒性应激的活性亲电物种之一（Yu et al，2013）。此外，通过TUNEL法检测细胞凋亡。结果表明，与对照组相比，CP / CPPS大鼠模型具有较高的氧化应激和细胞凋亡水平。 ED通常表现为海绵体内的平滑肌细胞丢失，胶原蛋白替代这些细胞并导致纤维化增加（Ferrini等，2007，2015； Zhang等，2016）。体纤维化在ED恶化中起关键作用，ED恶化了阴茎的弹性和顺应性。体纤维化的程度取决于胶原蛋白与平滑肌含量的比率，并且在ED小鼠中明显高于对照组（Shin等，2014）。越来越多的证据表明，炎症和氧化应激可能在体纤维化的病理机制中起重要作用（Duerrschmid等，2013； Kayama等，2015）。此外，抗氧化剂的处理可以抑制炎症细胞因子和胶原标记物的表达（Suzuki等，2015）。在我们的研究中，与对照组相比，EAP大鼠海绵体组织的平滑肌/胶原比率显着降低，这表明CP / CPPS导致海绵体的纤维化。
结论
这项研究表明，由CP / CPPS引起的内皮功能障碍在大鼠模型中导致ED。海绵体中eNOS表达水平和cGMP浓度的下降可能是CP / CPPS诱导的ED的重要机制。 CP / CPPS还增加了海绵体中的氧化应激状态，细胞凋亡并降低了平滑肌/胶原比，这对阴茎勃起功能都很重要。应该做进一步的研究以验证CP / CPPS和ED之间关系的分子机制。
致谢本研究得到上海市卫生和计划生育委员会地面项目（No. 201540201）的资助。