【原创】hisat2-samtools-htseq转录组分析记录2018-10-08-09-11 hisat2-samtools-htseq

hisat2 -t -x ~/rna_seq_analysis/reference/index/hg19/genome -1 ~/rna_seq_analysis/fastq/SRR5894154_1.fastq.gz -2 ~/rna_seq_analysis/fastq/SRR5894154_2.fastq.gz -S ~/rna_seq_analysis/aligned/SRR5894154.sam

之前出问题好像是因为少空了空格。

比对结果

http://blog.sciencenet.cn/blog-3334560-1078097.html


得到的sam格式文件40多G。。。。

我哭了。。。

下一步把sam文件转化为bam文件,用samtools

SAM格式是目前用来存放大量核酸比对结果信息的通用格式,也是人类能够“直接”阅读的格式类型,而BAM和CRAM是为了方便传输,降低存储压力将SAM进行压缩得到的格式形式。 注,BAM格式必须要建立索引才能快速读取指定位置的信息。

# 1.3版本前

samtools view -bS bwa.sam > bwa.bam

samtools sort bwa.bam > bwa_sorted.bam

samtools index bwa_sorted.bam

# 1.3版本后

samtools sort bwa.sam > bwa_sorted.bam

samtools index bwa_sorted.bam

1. 格式转换

2. 排序

3. 索引

大于号:将一条命令执行结果(标准输出,或者错误输出,本来都要打印到屏幕上面的)重定向其它输出设备(文件,打开文件操作符,或打印机等等)

1. samtools view -S SRR5894154.sam -b > SRR5894154.bam   

bam文件不到8g,于是赶紧把sam文件删了~

2. samtools sort SRR5894154.bam > SRR5894154_sorted.bam

3. samtools index SRR5894154_sorted.bam

//虽然我不知道第三步有什么用。。。


如果你要比较同一个样本(within-sample)不同基因之间的表达情况,你就需要考虑到转录本长度,因为转录本越长,那么检测的片段也会更多,直接比较等于让小孩和大人进行赛跑。如果你是比较不同样本(across sample)同一个基因的表达情况,虽然不必在意转录本长度,但是你要考虑到测序深度(sequence depth),毕竟测序深度越高,检测到的概率越大。除了这两个因素外,你还需要考虑GC%所导致的偏差,以及测序仪器的系统偏差。目前对read count标准化的算法有RPKM(SE), FPKM(PE),TPM, TMM等,不同算法之间的差异与换算方法已经有文章进行整理和吐槽了。

转录本水平上,一般常用工具为Cufflinks和它的继任者StringTie, eXpress。这些软件要处理的难题就时转录本亚型(isoforms)之间通常是有重叠的,当二代测序读长低于转录本长度时,如何进行区分?这些工具大多采用的都是expectation maximization(EM)。好在我们有三代测序。上述软件都是alignment-based,目前许多alignment-free软件,如kallisto, silfish, salmon,能够省去比对这一步,直接得到read count,在运行效率上更高。不过最近一篇文献[1]指出这类方法在估计丰度时存在样本特异性和读长偏差。

-f bam/sam: 指定输入文件格式,默认SAM

-r name/pos: 你需要利用samtool sort对数据根据read name或者位置进行排序,默认是name

-s yes/no/reverse: 数据是否来自于strand-specific assay。DNA是双链的,所以需要判断到底来自于哪条链。如果选择了no, 那么每一条read都会跟正义链和反义链进行比较。默认的yes对于双端测序表示第一个read都在同一个链上,第二个read则在另一条链上。

-a 最低质量, 剔除低于阈值的read

-m 模式 union(默认), intersection-strict and intersection-nonempty。一般而言就用默认的,作者也是这样认为的。

-i id attribute: 在GTF文件的最后一栏里,会有这个基因的多个命名方式(如下), RNA-Seq数据分析常用的是gene_id, 当然你可以写一个脚本替换成其他命名方式。

gene_id "ENSG00000223972.5_2"; transcript_id "ENST00000456328.2_1"; gene_type "transcribed_unprocessed_pseudogene"; gene_name "DDX11L1"; transcript_type "processed_transcript"; transcript_name "DDX11L1-002"; exon_number 2; exon_id "ENSE00003582793.1_1"; level 2;.

htseq-count -s no -r pos  -f bam ~/rna_seq_analysis/aligned/SRR5894154_sorted.bam ~/rna_seq_analysis/human_genome/gencode.v28lift37.annotation.sorted.gff3 > ~/rna_seq_analysis/aligned/SRR5894154.count

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