ChIP-seq之检峰

ChIP-seq的核心是检峰（Peak Calling），当然现成的工具有很多，其中MACS比较常用，本文以MACS v2为例进行检峰的原理和使用。

一、背景

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。

多种组学手段

二、实验

ChIP实验模式图

一、软件下载

著名代码托管网站github上有最新的开发版本： https://github.com/taoliu/MACS

二、软件使用

（1）双峰模型

检峰过程

MACS2是基于模型（泊松分布）的方法进行检峰的，上述示意图中的模型是双峰模型，目的是为了将比对上的Reads朝3`端偏移（shift），以更准确地得到蛋白-DNA互作的位置。

这里需要注意对于单端数据（SE）需要进行shift以评估平均插入片段大小（Insert Size）；若使用的数据为双端（PE）则直接使用真实的Fragment Size进行检峰。

（2）检峰

单链双峰模型

2.1 建立shift模型：

MACS2以固定大小窗口扫描基因组；取前1000个富集程度最好的峰；区分正/负链比对reads，评估d的长度；建立正/负链模型。

2.2 检测显著峰

Reads向中心Shift 1/2d的距离；以长度2d的窗口扫描全基因组得到显著富集的候选峰（基于泊松分布）； 合并重叠的峰。

# d：插入片段长度

三、峰型

（1） 窄峰 -转录因子等

专转录因子

（2） 混合峰 - 聚合酶II等

聚合酶II

（3）宽峰 -组蛋白等

组蛋白

四、如何使用

MACS2非常适合转录因子和组蛋白修饰类型的检峰。

使用MACS2时需要根据不同峰型进行参数的调整，软件说明文档参数如下：

常用参数：macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test  -q 0.01

宽峰参数：macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam --broad -g hs --broad -cutoff1

其中，-t为ChIP样本；-c为control样本即input；-f为输入文件的格式，一般使用BWA、Bowtie2比对后的BAM文件；-g有效基因组大小，MACS2内置了一些物种如人类是hs；-n为样本名称；-q为检峰显著性阈值； --broad为检测宽峰的阈值； -cutoff为筛选fold-enrichment的阈值。

针对转录因子类型为了得到结合位置的峰顶可以添加 --call-summits，另外--extsize具体数值可以使用macs2 predictd进行评估（例如评估值为200），检峰参数如下:

macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test --call-summits --nomodel --extsize 200 -q 0.01

针对组蛋白类型，需要合并邻近的峰形成宽峰，检峰参数如下：

macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test --broad --nomodel --extsize 173  -cutoff 2 -q 0.01

对于双端数据，-f参数为BAMPE，这时检峰所使用的插入片段长度为实际的平均插入片段长度，不需要建模（使用--nomodel，同时--extsize失效）

检峰之后就是检测基序（motif）了，链接：检测基序

五、其他软件

参考如下文章：

检峰软件比较

检峰精确性比较(NRSF基序)

六、参   考

[1] https://www.encodeproject.org/

[2] https://en.wikipedia.org/wiki/ChIP-sequencing

[3] https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/chip-seq.html