生物信息百Jia软件(一)——bwa

编者按

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前面写了专题《手把手教你生物信息分析平台搭建》,然后又介绍了很多《生物神奇网站》资源,也介绍了《生物信息之独孤九剑》Linux操作。那么万事俱备,就开始学习生物信息吧。所以,我们开始新的篇章——《生物信息百jia软件》。百Jia是什么意思呢?可以是百佳,也可以是百家,还可以是百加。从100家中选择100款优秀软件,掌握这些软件,就可以扩展出更多内容,这就是百Jia。

一、功能分类: 短序列比对

二、软件官网:

https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/

三、软件介绍:

随着以illumina为主的高通量测序技术的流行,短序列比对成为二代测序分析中的核心分析,短序列比对也就是将测序得到的短片段在回帖到基因组上,这个过程也被称为mapping。mapping的结果包含了所有的信息,后续所有的分析都是基于这个mapping的结果。像目前流行的RNAseq分析,外显子分析,全基因组WGS等都需要利用短序列比对,其实序列拼接里面也是首先进行短序列比对。可以说如果想分析二代测序的数据,就必须进行短序列比对。而在众多的短序列比对软件中,BWA几乎已经成为默认的行业标准。随着三代长片段测序技术的兴起,bwa也在进步,最新版本的软件改进了很多算法,增加了很多新功能。之前的版本不支持长reads,不能进行split reads的比对,因此在RNAseq中存在可变剪切,不能使用bwa比对。不过目前最新版本的bwa都解决了这些功能。

四、软件算法介绍:

目前版本的BWA主要使用三种算法,分别是BWA-backtrack, BWA-SW和BWA-MEM。其实之前短序列比对主要使用的是bwt算法,

(Burrows–Wheeler transform),bwa软件的名字也来源于利用bwt算法的aligner。

首先,BWA-backtrack,软件中的aln,samse,sampe比对都使用bwa-backtack算法中,主要适合比较短的reads,尤其是100bp一下的,不过目前很少了;BWA-SW中的SW 表示affine-gap Smith-Waterman),BWA-MEM中的MEM表示maximal exact matches。

BWA-SW和BWA-MEM都支持长read是和split比对,reads长度可以从70bp到1M,BWA-MEM是更新的算法,更快也更准确,是最推荐使用的算,也是使用范围最广泛的,Illumina, 454, Ion Torrent,Sanger,拼接的contigs 或者BAC 都可以使用这种算法,对于包含很多gap的情况,bwa-sw会更好些。所以很明显,目前的版本我们使用bwa-mem算法就行了。

五、下载安装

bwa安装并不难,可以直接下载源代码进行编译,只需敲make编译即可,注意系统环境中需要安装zlib库。

也可以直接利用apt工具下载,或者使用bioconda进行安装。

conda install -y bwa

六、软件使用:

直接敲bwa,弹出软件选项参数。比对还是分成两大步,建立索引,也叫做建库,然后是比对。首先,利用bwa index可以建立索引,输入参考序列的fasta格式文件,

-a 指定建立索引的算法,bwtsw,is或者rb2,以前没有rb2,而是div。is还是适合小于2G的基因组,bwtwt是大于10M的基因组才行,这个地方不要选错了,细菌基因组一般都小于10M,只能用is算法,人基因组是3G,只能用bwtsw,处于中间的选择哪个都可以。

-p 选项是输出前缀,一般不用设置,就是在参考序列名字后面多出很多文件。

bwa index human_g1k_v37.fasta

这样就开始建立索引,根据文件大小和机器配置不同,需要的时间也不同,对于人的基因组序列,可能需要几个小时,因此很多网站在提供参考序列的时候,连索引文件也一起提供,下载索引比自己建立索引文件要快很多。所以建立完成之后就可以进行比对了,一般是两条pairend的reads。当然其他测序平台的单端reads也可以。现在使用bwa-mem算法只需要两步就行了。bwa mem有很多选项参数,这里我们介绍几个比较重要的。

生物信息百Jia软件(一)——bwa_第1张图片

-R 设置reads标头,放到一对引号中,也就是sam文件中的RG部分,为什么要设置RG表头呢,因为同一样品可能包括多个测序结果,来自不同lane,不同文库,或者不同样品的比对结果合并到同一个文件中进行处理,就需要通过RG进行标记区分。RG每个标记用冒号分割键和值,不同标记用 '\t' 分隔。例如'@RG\tID:foo\tSM:bar\tLB:library1'

-M 这个选项也比较重要,因为bwa men在比对的时候,对于一条序列同时比对到基因组不同区域的情况,bwa认为都是最优匹配,但是会与Picard tools不兼容,影响后面GATK检测,这个时候可以设置-M选项,将较短的比对标记为此优,与picard兼容。

-t 设置线程数,多线程可以显著提高比对效率,因为数据比对大,影响还是非常显著的,现在整个行业想进各种方法来提高比对效率,包括提升硬件,在CPU底层优化,改进软件算法等,因为现在一个完整的人基因组比对还需要几个小时,GATK还需要一两天,如果提高计算速度,是非常有意义的。

-T ,给定一个分值,当比对的分值比设置的小时,不输出该比对结果;

-a 将所有的比对结果都输出,包括 single-end 和 unpaired paired-end的 reads

-p 智能的pairing,如果不设置,输入文件只有1个,则进行单端比对;若输入文件有2个,则作为paired reads进行比对。如果设置-p,则仅以第1个文件作为输入,输入的文件若有2个,则被忽略之

下面在看一下bwasw比对,因为使用了 Smith-Waterman,特别适合长reads比对,因为能够容许更多的gap情况。帮助文档中默认提示的就是query.fa,一般是长序列。帮助中提示对于长的Illumina 数据, 454,Sanger拼接的contigs或者 fosmids,BACs等,使用默认参数就行,如果是2010年之前Pacbio,设置'-b5 -q2 -r1 -z10'。

bwa bwasw genome long_read.fq > all.sam

bwa bwasw genome read1.fq read2.fq > all.sam

七、使用案例:

现有参考序列ref.fna,illumina测序两条reads,reads.1.fq.gz与reads.2.fq.gz。

bwa index ref.fna

bwa mem -R '@RG\tID:E1602061\tSM:bar\tLB:library1' -t 4 ref.fna

reads.1.fq.gz reads.2.fq.gz  >result.sam

八、注意事项:

1、安装时需要依赖zlib;

2、建库时注意选择正确的算法;

3、最新版本bwa,需要使用-R选项。

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生物信息百Jia软件(一)——bwa_第2张图片

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