正踪大米饭儿
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科普一下qPCR

一般情况下，我们做完RNA-Seq后最简单的验证就是做个 qPCR对获得的差异基因进行验证。因此这是一条将生信分析文件提升到科学实验文章的捷径。

qPCR 概念

qPCR的全称是实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)，其基本原理是使用仪器检测测试基因与内参基因表达量的差值进行定量，最终验证生信分析的结果。

qPCR步骤

RNA --> cRNA --> qPCR

  1. 提取总的RNA
  2. 使用反转录试剂盒反转录为cDNA
  3. 加样上机检测
  4. 结果分析

内参基因

植物中常用 Actin 或者 18S
动物中常用 β-actin

Example

前期生物信息学分析获得10个显著差异候选基因。为了验证这10个候选基因在不同样品或者不同处理下的表达差异情况，我们是用qPCR进行验证。

首先对10个基因设计引物，一般情况下可以直接检索文献，搜索别人使用成功的引物，或者搜索相应的引物数据库，拿到引物后使用oligo 6检测评价一下。

值得注意的是：1.上样时样本编号需要标记清楚，保持样本结果与内参编号一致。2.进行qPCR实验时每个样品设置3-4个重复。

至于定量结果的结算后期补充吧~

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