HISAT2+STRINGTIE+BALLGOWN 分析转录组数据

师兄推荐这篇文章，按照里面的命令，先做一套转录组分析。

参考文献：

Pertea M, Kim D,Pertea G M, et al. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experimentswith HISAT, StringTie and Ballgown.[J]. Nature Protocols, 2016, 11(9):1650.

全文链接：http://www.ccb.jhu.edu/people/infphilo/data/nprot.2016.095.pdf

我是借鉴的简书上的一篇博文，https://www.jianshu.com/p/38c2406367d5，谢谢这个博主啦！

数据 ：https://pan.baidu.com/s/1aX93Q65Dit3iqslRWkQcsw

  genes  针对基因组的注释文件.gtf

  genome  染色体X的序列文件 chrX.fa

  geuvadis_phenodata.csv 

  mergelist.txt  以上两个都是之前博主创建表明数据关系的文件

  indexes  hisat2对于染色体X的indexes文件，1~8.ht2 索引文件

  samples  数据  fastq.gz

文章背景： 见文章 

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转录组分析 背景知识： 

       从原始RNA-Seq数据着手，质控——建立索引文件——比对、拼接、排序——初组装——合并——计算表达量，并输出为baoogown格式——进行差异分析——作图，这里输出结果包括基因list、转录本，及每个样本的表达量，能表现差异表达基因的表格 并完成显著性计算。

       在R里使用ballgown处理需要得到：   #了解一下就OK

       1. 表型数据    关于样本的信息

       2. 表达数据    标准化和未标准化的关于外显子，junction，转录本，基因的表达数量

       3. 基因信息    有关外显子，junction，转录本，基因的坐标以及注释信息

       大多数差异表达分析都会包括一下几个步骤：       #需要着重理解

       1. 数据可视化和检查

       2. 差异表达的统计分析

       3. 多重检验校正

       4. 下游检查和数据summary

        ballgown的使用：    #分析过程的难点在ballgown，提前理解有助于后面，现在回过头来看还是很懵逼……

        1. 数据的读入

      2. 预测丰度的检查：以FPKM为单位的丰度预测将会根据library size进行标准化。FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）

        3. 使用线性模型进行差异表达分析，由于FPKM对于转录本解读过于曲解，所以这里需要使用log转化处理数据，随后再使用线性模型进行差异分析。 

        4. ballgown可以对于time-course和fixed_conduction数据进行差异分析，但是无法避免批次效应带来的误差。# 使用stattest功能可以指定任何已知的confounder

        5. ballgown 可以帮助你在基因、转录本、外显子、junction水平上进行差异分析。

        6. 结果会以表格形式展出，如果样本多还有p值和q值。

        7. 结果数据可以用来进行下一步的gene set分析（例如GSEA）等等。

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        正式分析开始（提前把文件解压好，数据解压出来&提前装好hisat2,stringtie,samtools,R,  ballgown到后面再装）

一、 质控，运行fastQC

nohup fastqc filename.fq  &

for i in *fastq; 
do
i=${i%fastq*}; 
fastqc ${i}fastq
done

#这是一个循环语句，文件12个，一个一个来就很累了，但是我也没有理解这个循环语句，照葫芦画瓢而已，改一下路径

#输出文件为filename.fastqc.zip，可在网页上看结果，或者Xmanager 6查看，因为文章里的数据很好，不用再进行筛选，就直接下一步   PS， nohup &  语句，是使命令在后台运行。

二、 HISAT2

       1. 使用hisat2-build建立索引文件（我的文件里已有索引文件，就不需要这一步）

hisat2-build -f  /注释文件路径/genome.fa  /索引文件输出路径/文件名.X.ht2

# -f 指定注释文件格式，默认为fa,可不填       运行成功后，会产生如下文件name.1.ht2 …… name.8.th2

       2. 使用生成的索引文件对RNA-Seq进行比对拼接

nohup hisat2 -p 8-x /home/czou/lixin/b/chrX_data/indexes/ -1 ERR188044_chrX_1.fastq -2 ERR188044_chrX_2.fastq -S ERR188044.sam &

for i in *1.fastq; 
do
i=${i%1.fastq*}; 
hisat2 -p 8-x /home/czou/lixin/b/chrX_data/indexes/chrX_tran -1 ${i}1.fastq -2 ${i}2.fastq -S ${i}.sam 
done

        3. SAM tools 排序及格式转换

samtools sort -@ 8 -o ERR188044_chrX_.bam ERR188044_chrX_.sam

for i in *.sam; 
do
i=${i%.sam*}; 
samtools sort -@ 8 -o ${i}.bam ${i}.sam  
done  

三、 stringtie 序列初组装

stringtie -p 8 -G /home/czou/lixin/b/chrX_data/genes/chrX.gtf -o ERR188044_chrX_.gtf ERR188044_chrX_.bam

for i in *.bam; 
do 
i=${i%.bam*}; 
nohup stringtie -p 8 -G /home/czou/lixin/b/chrX_data/genes/chrX.gtf -o ${i}.gtf ${i}.bam & 
done

合并

stringtie --merge -p 8 -G  /home/czou/lixin/b/chrX_data/genes/chrX.gtf -o stringtie_merged.gtf                                  /home/czou/lixin/b/chrX_data/mergelist.txt    

四、 检测转录本与参考注释的比较

gffcompare -r /home/czou/lixin/b/chrX_data/genes/chrX.gtf  -G -o merged stringtie_merged.gtf       

评估表达量，并为ballgown包提供输入文件

stringtie -e -B -p 8 -G /home/czou/lixin/b/chrX_data/samples/sam/gtf2/stringtie_merged.gtf -o                                              ballgown/ERR188044_chrX/ERR188044_chrX.gtf /home/czou/lixin/b/chrX_data/samples/fastq/ERR188044_chrX_.bam

for i in *_chrX_.bam; 
do 
i=${i%_chrX_.bam*}; stringtie -e -B -p 8 -G  /home/czou/lixin/b/chrX_data/samples/sam/gtf2/stringtie_merged.gtf -o ballgown/${i}/${i}_chrX.gtf  /home/czou/lixin/b/chrX_data/samples/fastq/${i}_chrX_.bam  
done

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Ballgown包

RSkittleBrewer（用于设置颜色）

genefilter（用于快速计算均值和方差）

dplyr（用于分类和排列结果）

devtools（用于再现性和安装包）

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五、 差异表达分析（在R中进行）    

1. 安装

source("https://bioconductor.org/biocLite.R") 
biocLite("ballgown")

library(dplyr) 
install.packages("dplyr")

library(devtools)
install.packages("devtools")

library(genefilter)
source("https://bioconductor.org/biocLite.R") 
biocLite("genefilter")

library("RSkittleBrewer")
devtools::install_github('RSkittleBrewer', 'alyssafrazee')

 

#加载要用的语言包
library(ballgown)
library(RSkittleBrewer)
library(genefilter)
library(dplyr)
library(devtools)

getwd()
set()  # 修改当前路径至数据位置，加“”

read.csv("geuvadis_phenodata1.csv")      #读取表型数据，数据分组信息
pheno_data <- read.csv("geuvadis_phenodata1.csv")

bg_chrX = ballgown(dataDir = "C:/Users/Administrator/Documents/R/hisat2 stringtie ballgown/ballgown",             samplePattern = "ERR", pData = pheno_data)
#dataDir 告知数据路径， samplePattern 依据样本的名字来， pData 指明数据关系，这里面的第一列样本必须和ballgown下面的文件名一样，否则会报错。

bg_chrX_filt = subset(bg_chrX, "rowVars(texpr(bg_chrX)) > 1", genomesubset = TRUE)
#滤掉低丰度的基因，这里选择过滤掉样本间差异少于一个转录本的数据

result_transcripts = stattest(bg_chrX_filt, feature = "transcript", covariate = "sex", adjustvars = c("population"), getFC = TRUE, meas = "FPKM")
result_transcripts   #确定组件有差异的转录本，在这里我们比较的性别之间的基因差异，指定的分析参数是“transcripts”，主变量是“sex",修正变量是
”population",getFC可以指定输出结果显示组间表达量的foldchange。

result_genes = stattest(bg_chrX_filt, feature = "gene", covariate = "sex", adjustvars = c("population"), getFC = TRUE, meas = "FPKM")
result_genes              #确定各组间有差异的基因

result_transcripts = data.frame(geneNames = ballgown::geneNames(bg_chrX_filt), geneIDs =                  ballgown::geneIDs(bg_chrX_filt), result_transcripts)
result_transcripts           #为组间有差异的转录本添加基因名？？？？？不理解

result_transcripts = arrange(result_transcripts, pval)   #按照p-value值从小到大排序
result_genes = arrange(result_genes, pval)

write.csv(result_transcripts, "chrX_transcript_results.csv", row.names = FALSE)     #将两个结果写到csv文件中
write.csv(result_genes, "chrX_gene_results.csv", row.names = FALSE)

subset(result_transcripts, result_transcripts$qval < 0.05)        #从以上的输出中选出q值<0.05的转录本和基因，即性别表达有差异的基因
subset(result_genes, result_genes$qval < 0.05)

tropical = c('darkorange', 'dodgerblue', 'hotpink', 'limegreen', 'yellow')        #赋予调色板5个指定颜色
palette(tropical)

fpkm = texpr(bg_chrX, meas = "FPKM")     #以FPKM为参考值作图，以性别作为区分条件

fpkm = log2(fpkm + 1)         #方便作图，将其log转化，+1是为了别面出现log2(0)的情况

boxplot(fpkm, col = as.numeric(pheno_data$sex), las = 2, ylab = 'log2(FPKM + 1)')

#以上完整做出箱线图

#就单个转录本做箱线图
ballgown::transcriptNames(bg_chrX)[12]
ballgown::geneNames(bg_chrX)[12]

plot(fpkm[12,] ~ pheno_data$sex, border = c(1,2),
      main = paste(ballgown::geneNames(bg_chrX)[12],' : ',
                 ballgown::transcriptNames(bg_chrX)[12]), pch = 19, xlab = "Sex",
      ylab = 'log2(FPKM + 1)')
points(fpkm[12,] ~ jitter(as.numeric(pheno_data$sex)),
       col = as.numeric(pheno_data$sex))  # 这一步作用是？？male做出来和原图有细微不同
       

 

 

#查看某一基因位置上所有转录本
# plotTranscripts函数可以根据指定基因的id画出在特定区段的转录本
# 可以通过sample函数指定看在某个样本中的表达情况，这里选用id=1750, sample=ERR188234
plotTranscripts(ballgown::geneIDs(bg_chrX)[1750], bg_chrX, main = c('Gene MSTRG.575 in sample ERR188234'), sample = c('ERR188234'))
#不成功？？？

#以性别为区分，查看表达情况

# 这里以id=575的基因为例（对应上一步作图）
plotMeans('MSTRG.575', bg_chrX_filt, groupvar = "sex", legend = FALSE)

 

还有一个图没有做成功，慢慢去找原因吧，ganbade