CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 3

不想说废话了，请允许我直接上实验步骤。

昨天我们先是（1）组合好了Oligo；然后（2）把Oligo通过酶切和连接实验插入到pSpCas9质粒中；接着（3）把这个质粒转化（transformation）到感受态细菌中；再来（4）把这细菌复活后涂0.1%氨苄西林抗生素LB平皿上，过夜培养12-16 h。

Day 2: inspect the plates for colony growth. Typically, there are no colonies on the negative control plates (ligation of BbsI-digested pSpCas9(BB) alone without annealed sgRNA oligo insert), and there are tens to hundreds of colonies on the pSpCas9(sgRNA) (sgRNA inserted into pSpCas9(BB)) cloning plates.

第二天：检查克隆生长情况。一般来说，阴性对照不会出现克隆，而阳性结果会有几十到几百个克隆。

From each plate, pick two or three colonies to check for the correct insertion of sgRNA. Use a sterile pipette tip to inoculate a single colony into a 3-ml culture of LB medium with 100 µg ml − 1 ampicillin. Incubate the culture and shake it at 37 °C overnight. 每块平板挑2-3个克隆去检查sgRNA的插入情况。

我的实验结果不错，对照组完全无克隆，实验组有约150个左右克隆，每个平皿挑了3个去扩增。
Day 4的我已经提了质粒，测了浓度，准备验证（因为明天要开组会+文献汇报，所以验证部分暂停）。

感谢师兄DZ