测序了，然后呢（三）功能注释整合流程

刘小泽写于19.1.16+19.1.19
随着不断地知识更新，之前不了解的东西开始变得熟悉，学习曲线就是这样

功能注释这么繁琐吗，有没有整合起来的流程？

之前看到，同源注释和功能分类都有各自的数据库和软件，并且同源注释还有两种方式，一步步操作会比较繁琐，因此就有软件看到了这个痛点，开发了新的整合式流程

• 最有名的blast2go：https://www.blast2go.com/ 顾名思义，它是从blast直接给你GO分类结果，一步到位，但是目前专业版开始收费最便宜1600欧元/license，但提供一星期的试用。那么专业版好在哪里，官网也做了说明，主要还是强调：数据库更新快，分析结果更准确，还会送一个AWS云计算（https://www.blast2go.com/blast2go-pro/cloudblast 不需要用户自己安装数据库，及时更新，加速等等）

  当然，基于blast软件，即使加持云计算优化，速度还是个问题；另外配置过程非常复杂

  

  blast2go

• Trinotate：做过无参转录组的小伙伴都应该用过拼接转录本的Trinity吧，同样，这款软件也是Trinity团队为功能注释开发的（他们真的想从头到尾全实现了啊），这个软件的程序全是基于perl，所以不了解perl就不知道怎么解决报错

• interpro+interproscan：部署也是个麻烦事，并且只支持基于结构域的注释，对KEGG、GO等数据库关联性不是很好

• eggnog-mapper：2016年基因家族数据库EggNOG v4.5.1开始进入大家的视野，这个团队为数据库开发了相应的注释软件。目前已开发出5.0版本（http://eggnog5.embl.de/#/app/home） 支持了5,090个物种，比上一个版本4.5.1高出一倍不止。另外支持的Orthologous Groups也有4.5.1的19w疯狂升级到440W，其中每个Orthologous Group的蛋白也都关联了GO、KEGG数据库
  

  

  eggnog

看来eggnog-mapper将是使用重点，那么它的设计原理是什么？

首先是比对，将要研究的序列与Eggnog中的蛋白序列进行比对，这个过程可以是基于相似性（DIAMOND），也可以是基于结构域（HMMER）；

比对完以后就知道了我们提交的序列与哪个Orthologous Group最相似，并且还能知道与什么物种相似度最高，帮助确定注释的物种（真核还是原核，植物还是动物）；

然后通过数据库之间关联进行COG、GO、Pathway的功能分类

eggnog

安装eggnog-mapper

下载地址：https://github.com/jhcepas/eggnog-mapper/releases

另外还有详细的帮助文档：https://github.com/jhcepas/eggnog-mapper/wiki/Installation

或者直接conda安装eggnog-mapper

install

可以看到：这个软件基于python2.7，需要200G左右的硬盘空间，并且对于真核生物需要90GB的内存，细菌大约32G内存，古细菌10G内存 （因为使用快速模式的话，会把数据库一次性加到内存中）

下载数据库

它构建了107个各个层级的物种注释数据库

在这里http://eggnogdb.embl.de/#/app/downloads可以下载特有的数据库

当然也可以用download_eggnog_data.py euk bact arch viruses -y下载真核、细菌、古细菌、病毒（euk、bact、arch、viruses）的数据库

【如果是用conda安装的，命令可以直接使用；但自己手动安装的，需要把软件放入环境变量，并且还需要在开头加一个python2表示用python2进行编译】

database

下载完成看看，主要包括以下内容：

其中OG_fasta存储fasta文件；eggnog.db存储eggnog数据库中的蛋白序列ID与GO、KEGG等其他分类数据库的对应关系； eggnog_proteins.dmnd是diamond的数据库；hmmdb_levels这个文件夹存储HMMER的数据库

OG_fasta/         eggnog.db             hmmdb_levels/
OG_fasta.tar.gz  eggnog_proteins.dmnd  og2level.tsv.gz

配置好了，然后看看怎么用

如果使用conda安装，直接激活安装的环境，然后emapper.py -h 查看帮助文档

-m {hmmer,diamond}    Default:hmmer #设置模式，默认是hmmer
-i                    Input FASTA file containing query sequences #输入的文件FASTA
-d       specify the target database #指定数据库(euk,bact,arch，viruses从中选择一个)
-o         base name for output files #设置输出文件前缀
--usemem #[可选]针对hmmer模式(一次性将数据读入内存，快速处理，真核生物推荐90G以上内存服务器使用)

首先看比对模式有两种：diamond、hmmer

• diamond（对于大量的序列比如多于1000条）

  $ cat >diamond.sh
  emapper.py -m diamond \
           -i test.fa \
             -o diamond 
  # 不需要指定数据库 -d
  

• hmmer（少量序列比对少于1000条）

  $ cat >hmmer.sh
  emapper.py -m hmmer \
           -i test.fa \
             -d euk \ #(bact/arch/viruses)
             -o hmm-euk \
             --usemem 
  

实际运行下病毒的测试数据

这里选用的是Zaire ebolavirus病毒蛋白数据，因为很小所以比较好操作

数据下载

esearch -db protein -query PRJNA257197 | efetch -format=fasta > protein.fa

先构建小数据，随机选100条蛋白序列

$ seqtk sample protein.fa 100 > test.fa
# cat >hmmer.sh
$ emapper.py -m hmmer \
           -i test.fa \
           -d viruses \
           -o hmm-vir \
           --data_dir /YOUR_PATH/eggnog-mapper-1.0.3/data
# sh hmmer.sh 十几秒就运行完

emapper结果

# 然后把结果改一下，去掉#开头的行(但是保留query_name这一行的表头信息)
$ sed -i '/^# /d' hmm-vir.emapper.hmm_hits.annotations
# 然后再去掉query_name前面的#，并且去掉第一行的空行
$ sed -i 's/#//' hmm-vir.emapper.hmm_hits.annotations | sed '/^$/d' 

修改后的结果

得到了自己的eggnog-mapper结果后，只是搭建了一个桥梁，接下来就是构建自己的OrgDb，再进行GO、KEGG等富集分析
【在OrgDb这一步存在许多选择：
首先，如果研究的物种是模式物种，那么直接就可以用bioconductor上的注释包；
如果非模式物种而且有人构建过的话，就会上传到AnnotationHub，自己先用hub <- AnnotationHub() + display(hub) + query(hub, "拉丁名")看看上面有没有；
如果也没有，就可以利用eggnog的结果自己进行构建。当然即使AnnotationHub上有，我们也可以自行根据eggnog的结果进行构建，然后比较下和别人的结果】

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