2019-01-09

该研究的思路：

1.使用全基因组的CRISPR-Cas9，然后Illumina 测序gRNA的表现度，使用MaGeCK根据所有gRNA的平均log2倍数改变（LFC）和错误发现率（FDR）确定候选基因，使用超几何分布统计特异性消耗gRNA或富集gRNA基因的基因集和通路。

最终鉴定出了：

①使肿瘤对细胞毒性T细胞介导杀伤具有抗性的Cd274,Ptpn2和Serpinb9基因

 ②突变缺失导致肿瘤对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性的基因MHCⅠ类分子相关基因和IFNγ信号通路基因。

③Ras/MAP激酶通路，Ras通路在人类肿瘤中被激活是非常普遍的，也许不仅促进肿瘤细胞生长还削弱肿瘤免疫力。

④对T细胞介导杀伤的抗性通路：NF-kB通路，PBAF复合物，关键代谢通路（mTORC1，糖酵解和烟酰胺代谢）

2.根据（1）|LFC|>2，（2）FDR <0.05，和（3）已知的人类同源物3个标准进行验证。构建微型池gRNA文库筛，然后进行Pmel-1和OT-I筛选，对gRNA的表现度进行测序，对鉴定出的基因和通路进行二次筛选验证。

3.由于NF-kB通路被Manguso等人鉴定为一种抗性机制，因此该研究对B16F10-Cas9细胞中的NF-kB通路进行研究，对照组试验证明这种基因的失活不仅仅增加细胞死亡；代表性基因(Otulin, Dusp6 或者 Nf1) 在B16F10-Cas9细胞中失活没有使它们对阿霉素诱导细胞死亡更敏感。

4.分析鉴定出的PBAF复合物使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性的影响。

（1）PBAF复合物与肿瘤免疫的临床相关性。

缺陷的B16细胞（GFP阳性）与对照组B16F10细胞（GFP阴性）以1：1的比例混合。IFNγ刺激这些细胞24小时，然后在6孔板中以不同的效应物与靶标的比率与体外活化的Pmel-1T细胞共培养，FACS测定存在或不存在T细胞时突变体B16F10细胞的倍数消耗，比较突变细胞（GFP阳性）与对照B16F10细胞（GFP阴性）的百分比。

使用TCGA  RNA-seq数据库和TIMER检测CRISP筛选PBAF复合物在人类肿瘤中的相关性。发现了ARID2和PBRM1 的mRNA 水平与许多人类肿瘤类型的GZMB 和PRF1的 mRNA水平成负相关，表明了ARID2 和 PBRM1的低表达有助于人类肿瘤中CD8T细胞的高细胞毒性相关。这种相关性不仅仅通过CD8T细胞的浸润程度来解释，ARID2和 PBRM1 的 mRNA水平也与GZMB/CD8A的比例成负相关。此外，我们发现低ARID2 mRNA水平与黑素瘤患者的实质生存益处相关，但仅适用于CD8 T细胞浸润程度较高的肿瘤（基于CD8表达）。这些数据表明ARID2和PBRM1影响多种人类癌症中的肿瘤免疫。

（2）PBAF复合物与免疫检查点阻断疗法的相关性。

构建编码PBAF复合物独特组份的三个基因Arid2，Brd7或Pbrm1基因单独缺陷的B16F10细胞系，WB鉴定Arid2，Brd7或Pbrm1基因敲除后相应的蛋白表达水平。对照组或Pbrm1缺陷型B16F10-Cas9细胞经皮下注射到7至8周龄雄性C57BL/6小鼠中。对植入对照或Pbrm1缺陷型B16F10肿瘤细胞的小鼠三个治疗组进行比较：CD8消耗，aCTLA-4加上αPD-1和同种型对照抗体，FACS分析T细胞浸润的肿瘤细胞。对分选出来的CD45 +免疫细胞的单细胞RNA-seq分析。

结果：蛋白质免疫印迹证实Arid2的失活降低了Brd7和Pbrm1的蛋白质水平，而Pbrm1的失活不影响Arid2或Brd7的蛋白质水平。因此，具有局部染色质重塑活性的复合物可能任然保留在一些敲除细胞系中。突变细胞系与对照组用gRNA转导的B16F10-Cas9细胞在三天的共培养试验中相比，Arid2，Pbrm1或Brd7突变肿瘤细胞与细胞毒性T细胞的共培养导致PBAF的消耗增加。然而，Arid2，Pbrm1或Brd7基因的失活在两周内没有改变细胞增殖。 PD-1加上CTLA-4抗体在携带Pbrm1突变体B16F10肿瘤的小鼠中授予治疗益处，但是这种治疗对对照B16F10肿瘤无效。FACS分析 发现CD45 +免疫细胞的数量显著增加，CD4和CD8 T细胞以及B + CD8T细胞颗粒酶出现Pbrm1缺陷细胞与用PD-1加CTLA-4检查点阻断处理的对照组B16F10肿瘤细胞相比。

---

--------------------------------分 割 线--------------------------------------

（3）PBAF复合物调控B16F10肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性的分子机制.

方法：提取PBAF缺陷型B16F10细胞的总RNA，进行RNA-seq检测分析PBAF缺陷型B16F10细胞的转录组。RNA-seq数据做基因富集分析，目的在于观察PBAF缺陷型细胞系在IFNγ处理下，相关基因的表达情况。ELISA分析PBAF缺陷型细胞系的趋化因子分泌水平；RT-PCR检测趋化因子的mRNA水平。流式细胞仪分析PBAF缺陷型细胞在应答IFNγ时的H2-Kb和PD-L1的表位水平。

结果：①RNA-seq转录组分析显示Arid2和Pbrm1缺陷的B16F10细胞具有相似的基因表达谱，与它们在PBAF复合物中的关键作用一致。Brd7突变体B16F10细胞的转录组更明显，表明Brd7还有具有不依赖PBAF的功能。与对照组B16F10肿瘤细胞相比，Arid2和Pbrm1突变细胞中许多代谢途径的mRNA一致地下调，特别是与mTORC1活性和胆固醇体内平衡相关的基因集。②RNA-seq和基因富集分析显示，与用IFNγ处理的B16F10细胞对照组相比，在Arid2和Pbrm1缺陷细胞中一致上调的基因中与IFNγ 和IFNα应答相关的基因集显著富集，表明Arid2和Pbrm1抑制IFNγ应答基因的表达。许多IFNγ应答基因被抑制与Arid2和Pbrm1是抗病毒免疫还是编码的趋化因子。③RT-PCR分析显示与对照组细胞相比，Pbrm1缺陷型细胞系中Cxcl9 的mRNA水平显著升高。④ELISA实验显示在IFNγ刺激后，与对照组B16F10细胞相比，Pbrm1缺陷型肿瘤细胞能充分地分泌更大量的Cxcl9和Cxcl10趋化因子。⑤流式细胞仪分析显示与对照组B16F10细胞相比，在一定浓度的IFNγ浓度下，Arid2缺陷型细胞具有显著增加的H2-Kb表位水平，但是，所有三种突变体都显示出应答IFNγ的PD-L1表位水平增加，这可能是由于部分复合物的活性仍然保留在敲除细胞系中。 这些数据表明，Arid2和Pbrm1减弱了B16F10肿瘤细胞对IFNγ的应答能力，而IFN是肿瘤细胞和T细胞间相互作用的细胞因子。因此，PBAF复合物通过调控应答IFNγ基因的表达和mTORC1通路调控肿瘤细胞对T细胞介导杀伤敏感。

（4）上文已经阐述了PBAF复合物调控应答IFNγ基因的表达而调节肿瘤细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性，那么它是如何调控应答IFNγ基因的表达的呢？由于PBAF复合物属于染色质重塑复合物（主要调控染色质对转录因子的可接近性），那么它是否是通过调节IFNγ诱导基因的表达的染色质可接近性来调节转录因子的结合而影响转录的呢？

方法：使用ATAC-seq分析Pbrm1缺陷型细胞系在有和没有IFNγ处理的情况下的染色质可接近性并进行了motif和靶基因预测分析。

结果：在IFNγ处理后，Pbrm1缺陷细胞系与对照B16F10细胞相比大体上更多的基因组位点是可接近的。在Pbrm1缺陷型细胞系中IFNγ处理之前，648位点更容易接近，表明相应的基因准备应答IFNγ，2708个位点与对照组B16F10细胞相比，在Pbrm1突变体随着IFNγ暴露显示出增强的可接近性，但是它们在缺乏IFNγ的两种细胞系中的可接近性相似。motif和靶基因预测分析表明这些位点高度富集IRF （干扰素调节因子）motif并与IFN调节基因相关。因此，Pbrm1的失活增强了染色质对许多IFNγ诱导基因的启动子/增强子的转录因子的可接近性。

结论：对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性受肿瘤细胞中许多基因和通路调控，相应的基因产物可以代表免疫疗法的靶标，因为失活突变使肿瘤细胞对T细胞介导的攻击敏感。PBAF功能缺失增加肿瘤细胞对γ-干扰素的敏感性，导致招募T细胞效应因子的趋化因子分泌增强。当Pbrm1失活时，抗肿瘤治疗对免疫疗法变得敏感。在许多人类肿瘤中，PBRM1和 ARID2的表达与T细胞细胞毒性作用基因的表达成负相关，鼠科黑色素瘤的Pbrm1缺失后被T细胞细胞毒性浸润更强烈。