2019-12-20 学习记录3

质控

trimmomatic 去接头

Trimmomatic工具是用于illumina二代测序数据的reads处理，主要对接头(adapter)序列和低质量序列进行过滤。
一般的质控软件在处理含有接头序列的 reads 时，通常采用 "在允许错配的情况下，如果分析的 read 匹配一定数量的接头序列即去除这条 read 或从匹配开始的位置截断 read，仅保留匹配位置之前的部分序列" 的方式。
如果采取 "去除含有接头序列的 reads" 的方式，会造成测序数据的浪费 (如果片段选择没有控制好，整个 lane 会有很大一部分数据含有接头序列，怎么办？);
如果采取 "从匹配开始的位置截断 read，仅保留匹配位置之前的部分序列" 的方式，对于只含有少数几个碱基的 reads，普通的质控软件是处理不了的（又该怎么办？）。
But，Trimmomatic 有两种模式：Single End Mode 和 Paired End Mode，对于单端测序数据，它和其它软件相比没有明显的优势；但如果是双端测序的数据，Trimmomatic 采用两种去接头方式，更强大，更彻底！
普通模式：匹配一定数量的接头序列即截断序列，保留匹配起始位置之前的序列，如下图中A、B 所示： A、如果从 reads 的开始就匹配到接头序列的话，整条 reads 会被去除； B、如果是从 reads 的其它部分匹配到接头序列，则从匹配的位置截断序列，保留包含接头的部分。
超级强大的回文模式，如上图 Ｃ和 D 所示：想要了解回文模式去接头的原理，我们需要先熟悉一下：测序结果中的接头序列来自哪里？ 由于只有当插入片段的长度小于测序的读长时才会在测序结果中出现接头序列。那么对于含有接头的片段，正反向的 reads 在除接头之外的部分应该是反向互补的。因此，对于双端测序数据的处理上，Trimmomatic 在考虑接头匹配情况的同时也检查正反向 reads 的序列，从而更加有效的去掉接头序列。理论上，即使 read 仅含有 1 个碱基的接头序列，这 1 个碱基也能被切除！

原理

in/output

java -jar Trimmomatic/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 10 -trimlog 01_cleandata/${infile}/${infile}.logfile 
/Rawdata/${infile}/${infile}_R1.fq.gz /Rawdata/${infile}/${infile}_R2.fq.gz 
01_cleandata/${infile}/${infile}_clean_R1.fq 01_cleandata/${infile}/${infile}_clean_unpaired_R1.fq 
01_cleandata/${infile}/${infile}_clean_R2.fq 01_cleandata/${infile}/${infile}_clean_unpaired_R2.fq  
ILLUMINACLIP:/mnt/raid1/data/Software/Trimmomatic/adapters/TruSeq2-PE.fa:2:30:10  SLIDINGWINDOW:15:30 MINLEN:110 TRAILING:30 AVGQUAL:30

PE 设置使用trimmomatic处理双端数据，单端数据用(‘SE’)
-thread 16 设置线程数为16
-phred33 设置碱基的质量格式(默认-phred64，自v0.32版本之后可自动识别是phred33还是phred64)
-trimlog trim.log 设置trimmommatic工具处理的日志文件为’trim.log’，每两行为一对reads信息
ILLUMINACLIP:"adapter"/Exome.fa:2:30:9:1:TRUE，这部分指定2种去接头模式的参数："adapter"/Exome.fa:2:30:9:1:TRUE，这部分指定2种去接头模式的参数："adapter"/Exome.fa 指明需要匹配的接头文件，2 代表 16 个碱基长度的种子序列中可以有 2 个错配，30 代表采用回文模式时匹配得分至少为30 (约50个碱基)，10 代表采用简单模式时匹配得分至少为10 (约17 个碱基)；
LEADING:20，从序列的开头开始去掉质量值小于 20 的碱基；
TRAILING:20，从序列的末尾开始去掉质量值小于 20 的碱基；
SLIDINGWINDOW:4:15，从 5' 端开始以 4 bp 的窗口计算碱基平均质量，如果此平均值低于 15，则从这个位置截断 read；
MINLEN:36， 如果 reads 长度小于 36 bp 则扔掉整条 read。

下载

wget http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic/Trimmomatic-0.38.zip
unzip Trimmomatic-0.38.zip 
java -jar~/biosoft/Trimmomatic/Trimmomatic-0.36/trimmomatic-0.36.jar –h

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fastqc

fastqc -o output dir -f fastq|bam|sam seqfile1 .. seqfileN

fastQC