扩增子分析还聚OTU就真OUT了，试试unoise3
宏基因组领域是当今热门领域，也正是方法快速发展和变革的时代。之前还把 97%聚类OTU作为扩增子行业的金标准。转眼间各位大佬纷纷向OTU聚类方法拍砖，都不建议再使用。
Feature代替OTU是趋势
之前我翻译整理的QIIME2官方帮助文档——宏基因组扩增子最新分析流程QIIME2-了解分析趋势，读过的朋友会发现，里面的每个分析流程中都不再使用聚类方法生成OTU，而是调用DADA2 [1]对原始数据进行去噪，相当于以100%的相似度聚类，而仅仅对低质量序列进行去除和校正，算法识别去嵌合等；去噪的序列直接去冗余，即Feature(特征)，也不再叫OTU。换了新名字，还是很不适应，本文我们还是叫OTU吧。
其实我理解，仍叫OTU问题也不大，本质上还是可操作分类单元。因为限技术和认识的限制，没有更好的方法，当前就是最好的方法。OTU和菌永远不是绝对1：1对应的，1个OTU可能包括多种菌，而一种菌也可以包括多个OTU(rDNA可以多拷贝，且拷贝间不一定完全相同)。
我理解此方法的优点主要有：
- 最大的进步是提高了种、株识别率
- 降低结果中OTU假阳性的比例；
- 有利于后续的实验和功能分析
DADA2简介
DADA2是2016年6月发表在Nature Method上[1]，截止2017年10月9日Google统计引用76次。其实原理并不复杂，感兴趣的可以阅读原文，NCBI就有免费的全文。
这里只对文章中仅有的两幅图的结果简介。
图1. DADA2[1]与UPARSE[2]结果比较。结论就是比之前的UPARSE方法更好，可以看到更多真实的OTU，进一步去除假阳性、减少假阴性结果等；
图2. 对人类怀孕期阴道卷曲乳杆菌株水平分析。可以看到6种不同的菌株不同时期的丰度变化。而之前的OTU 97%聚类是看不到株水平差异的，也是聚类最大的问题。
dada2是个R包，源码地址：https://github.com/benjjneb/dada2
安装也非常简单
source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite("dada2")在QIIME2中是推荐的方法，可以直接调用。单独使用它，推荐阅读R包主页的帮助文档[3]。
unoise算法
看见dada2的文章孬自己的UPARSE方法不够好，Usearch大神Robert C Edgar怎能示弱，马上回家编写了unosie2 [4]，10月份(dada2文章出版三个多月后)直接把unoise2算法丢在了biorxiv(预印本杂志、无需同行评审)上 https://doi.org/10.1101/081257 。原文摘要只有3句话，最后一句直接説，我的unoise2比dada2更准确(it has comparable or better accuracy than DADA2)。
文章只仅有两张图，我们简要介绍一下：
图1. unoise2的去噪原理。左图展示，高丰度的序列周围存在很多相近的低丰度序列，大部分是由于PCR和测序过程引入的。图右为去噪去后unique序列结果。
图2. 比较UNOISE2和DADA2在土壤样品中嵌合体预测的结果。结论就是説自己的算法比dada2考虑的更周到，结果更好。
原理的简介也可查看unoise的帮助页
http://www.drive5.com/usearch/manual/unoise_algo.html [5]。
unoise3生成OTU实战
上文提到dada2説比uparse更好，然后Edgar写了unoise2説比dada2更好。现在已经出了unoise3，我们当然要马上用了。
为了区别与之前97%聚类OTU的不同，作者将unoise3的结果命名为zotu。
unoise3只是usearch软件中上百个功能之一，还没用过usearch，快读读《扩增子分析神器USEARCH简介
》
文中使用所有文件下载链接：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密码：y33d
本文的分析，是建立在扩增子分析流程基础上，想要了解每个文件的由来，请阅读《2扩增子分析流程：零基础自学-把握分析细》。
本方法是对上面链接中分析流程中第3节——聚类，和第4节——生成OTU表的另一种选择，并对结果进行简单比较。
# 97% cluster_otus聚类方法
# 聚类
./usearch10 -cluster_otus temp/seqs_unique.fa -otus temp/otus.fa -uparseout temp/uparse.txt -relabel Otu
# 生成OTU表
./usearch10 -usearch_global temp/seqs_usearch.fa -db temp/otus.fa -otutabout temp/otu_table_clusterotu.txt -strand plus -id 0.97 -threads 10
# 注：原流程中很多去嵌合、去非细菌序列的步骤是可选的，要根据具体需要是否添加。这里仅作聚类和OTU表生成的演示
# unoise3非聚类方法
# 使用unoise3非聚类直接去噪生成OTU，默认丰度阈值是reads>=8
usearch10 -unoise3 temp/seqs_unique.fa -zotus temp/zotus.fa -minsize 8
# 格式化OTU ID，不然下游分析会出现OTU表没有ID的问题
awk 'BEGIN {n=1}; />/ {print ">OTU_" n; n++} !/>/ {print}' temp/zotus.fa > result/zrep_seqs.fa
# 使用otutab mapping生成OTU表
usearch10 -otutab temp/seqs_usearch.fa \
-zotus result/zrep_seqs.fa \
-otutabout temp/otu_table_raw.txt \
-threads 9 # -id ${sim} -mapout ${temp}/zmap.txt
biom convert -i temp/otu_table_raw.txt -o temp/otu_table_raw.biom --table-type="OTU table" --to-json表1. cluster_otus与unoise3方法比较
| Method | OTU number | Mapped reads % |
|---|---|---|
| cluster_otus | 5486 | 58.7% |
| unoise3 | 4187 | 62.6% |
现在的结果是非聚类产生了更少的OTU，而可用数据比例反而增加了。
关于unoise3更详细的使用方法，可以阅读官方帮助文档[6]。
具体的好用之处，需要结合具体的科学问题来讨论吧。它们最大的优势是dada2文章图2中所示的菌株水平的分析。马上一大波基于此方法的新研究，正走在发表的道路上。
Biostack导读unoise2
在biostack上看到了一段unoise2的介绍，写的不错，同时分享给大家[7]。
UNOISE2：通过对Illumina测序平台结果错误纠正进行微生物多样性分析。Usearch主要三点： 1. 序列相似性比对， 2. 微生物多样性数据处理，逐渐构成了小生态，3. 序列处理瑞士军刀， 三点上竞争对手都很多， 第一点上 diamond 、RAPSearch等都是竞争对手，第二点 Usearch 紧随其后，另外还有 [QIIME 、Mothur 等老牌工具， 第三个问题太多了，主要有 seqtk 、 seqkit 等。 不过这个帖子提到的是新出炉的 UNOISE2，就是错误纠正（这类工具也很多）， 包括了去除测序错误的序列，嵌合体序列，Phix 污染序列以及低复杂度序列等， 然后就可以直接构建 OTU表了，UNOISE2 流程推荐直接从最原始的序列开始，合并双端序列、过滤、去冗余、错误纠正、序列比对、构建OTU表、一气呵成。 另外：可以增加调整序列方向这一步，需要参考序列库，比如 RDP 的序列库，或者使用 Silva 的库。不得不提 Usearch 工具使用序列： 32位版本不管是工业界还是学术界随便用，免费， 64位版本需要进行收费了，学术界要比工业界便宜不少，现在刚进入 9.0版本，销售策略也进行了调整，从先前按年订阅， 变成现在 按大版本号订阅 ，更人性化了。
Reference
- Callahan B J, McMurdie P J, Rosen M J, et al. DADA2: high-resolution sample inference from Illumina amplicon data[J]. Nature methods, 2016, 13(7): 581-583.
- Edgar, R.C. (2013) UPARSE: Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads, Nature Methods [Pubmed:23955772, dx.doi.org/10.1038/nmeth.2604].
- http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/dada2.html
- UNOISE2: Improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon read. bioRxiv, 2016
- http://www.drive5.com/usearch/manual/unoise_algo.html
- http://www.drive5.com/usearch/manual/cmd_unoise3.html
- http://www.biostack.org/?p=275
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写在后面
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