16/10/2019 一步步学会分析ATAC-seq

https://zhuanlan.zhihu.com/p/20702684  关于illumina 测序的原理

so, 我的测序结果是paired-end sequencing 并且是在不同的lanes上测序的。原始名称为：

larvae1_S1_L001_R1_001.fastq.gz ,

larvae1_S1_L001_R2_001.fastq.gz ,

larvae1_S1_L002_R1_001.fastq.gz ,

larvae1_S1_L002_R2_001.fastq.gz ,

larvae1_S1_L003_R1_001.fastq.gz ,

larvae1_S1_L003_R2_001.fastq.gz ,

larvae1_S1_L004_R1_001.fastq.gz ,

larvae1_S1_L004_R2_001.fastq.gz ,

#首先我需要把不同lane的sequencing 串联起来：

cat  larvae1_S1_L001_R1_001.fastq.gz  larvae1_S1_L002_R1_001.fastq.gz  larvae1_S1_L003_R1_001.fastq.gz larvae1_S1_L004_R1_001.fastq.gz > larvae1_R1.fastq.gz

cat  larvae1_S1_L001_R2_001.fastq.gz  larvae1_S1_L002_R2_001.fastq.gz  larvae1_S1_L003_R2_001.fastq.gz  larvae1_S1_L004_R2_001.fastq.gz  > larvae1_R2.fastq.gz

#接下来是质控： FastQC 继续在linux执行

 module load fastqc

fastqc larvae1_R1.fastq.gz

fastqc larvae1_R2.fastq.gz

#接下来是去除adapter

有两种方法， cutadapt 是用于知道adapter序列的情况下； NGmerge 用于不知adapter序列的情况下， 并且只能用于paried-end测序的情况下。NGmerge 好像依赖于GCC,zlib OpenMP安装这些都是很头疼，我不知道怎么弄，直接用conda install zlib/GCC/OpenMP/NGmerge这样安装了。 

module load NGmerge 

NGmerge   -1 larvae1_R1.fastq.gz -2 larvae1_R2.fastq.gz  -o larvae1  -a

// 

或者 NGmerge  -a -1 larvae1_R1.fastq.gz -2 larvae1_R2.fastq.gz  -o larvae1  -v

输出的文件为： larvae1_1.fastq.gz  和 larvae1_2.fastq.gz

接下来是和基因组匹配：

这里有一个比较重要的是，基因组序列必须建立索引。

module load bowtie2

bowtie2-build Amphimedon_queenslandica.Aqu1.dna.toplevel.fa  Amphimedon_queenslandica.Aqu1.dna.toplevel

方法一：

bowtie2 -p 15 -x /opsin/u/huifang/ATAC-Seq/larvae1/ATAC-seq1017/Amphimedon_queenslandica.Aqu1.dna.toplevel  -1 larvae1_1.fastq.gz  -2 larvae1_2.fastq.gz -S larvae1.sam

得到了一个很大的sam文件。 

比对之后输出为sam文件，该文件包括了匹配信息。 然后Sam文件应该被压缩成bam文件，通过软件samtools 来实现。

grep -v "XS:i:" larvae1.sam |samtools view -bS - >larvae1-1.bam

samtools  view -h larvae1-1.bam|less -SN

得到一个bam文件，bam是sam的压缩版文件，占空间少。

方法二：

以上也可以直接从bowtie2到samtools view and samtools sort, 输出bam 文件，

module load bowtie2   # if not already loaded
module load samtools
bowtie2  --very-sensitive  -k 10  -x Aqu2.1_Genes_mRNA  -1 larvae1_1.fastq.gz  -2 larvae1_2.fastq.gz  \
  |  samtools view  -u  -  \
  |  samtools sort  -n  -o larvae1  -

这一步可能会比较慢。查看bam文件用： samtools view -h larvae1.bam| less -SN

但是我的bam文件都是这个样子，没有其他信息。。。。不知道是否正确。。。

总结，上述两种方法我都试了，结果还是先转换为sam文件然后转换为bam文件比较靠谱。第二个一步法不行。。。得到的数据不全，虽然不知道为什么。。。

samtools sort -n larvae1.bam -o larvae1_1.bam

新的bam文件为queryname 比对后的bam文件，要不然没法用Genrich.

#接下来是peak-calling

Harvard Uni 推荐使用新的软件Genrich 可以从Github下载。 好处是可以出去线粒体reads, PCR duplicates, 用于多重mapping分析，以及分析多个replicates. 适用于ATAC-seq的线性匹配解释。 Harvard对比了之前的MACS2之后，推荐使用 Genrich. 

软件可以从Github 下载，conda install Genrich 安装

第一次尝试：

Genrich  -t larvae1_1.bam  -o larvae1.narrowPeak  -f larvae1.log -r -x -q 0.05 0a 20.0 -v -e chrM

Genrich -P -f larvae1.log -o larvae1_p01_a200.narrowPeak -p 0.01 -a 200 -v 

这步出来了540多个peak. 

第二次尝试：
Genrich -t larvae1_1.bam -o larvae1.bed -j -y -e chrM -v 

出来了835个peak。

#结果我觉得得到的peak都太少了，我还是用了MACS14，去callpeak.

macs14 -t larvae1.bam -f BAM -n larvae1019 -B 

结果呢，这个跑了大概14个小时，得到了大概一万六千个peak.  以及excel表格，和peak.bed 文件，以及R脚本。通过运行得到的R脚本，可以得到peak Model 的图谱，然后也可以根据这个excel表格得到Peak分布的柱状图。 

接下来的步骤都是在R里进行的，可根据chipseeker 的document 来操作。 主要使用了peaks.bed这个文件 

#接下来是注释：使用chip-seeker 在R里运行，chipseeker 是一个R包

使用ChIPseeker需要准备两个文件：一个就是要注释的peaks的文件，需满足BED格式。另一个就是注释参考文件，即需要一个包含注释信息的TxDb对象。我从上面的分析得到了peak.bed文件。但是没有TxDb 文件啊，使用方法是从Ensembl下载gff格式的基因组文件，然后使用GenomicFeatures 包来制作TxDb. 

require(GenomicFeatures)
spombe<-makeTxDbFromGFF("Amphimedon_queenslandica.Aqu1.45.gff3")
这样就可以了。

使用chipseeker, 第一步，安装相关的包。这里必须记一下chipseeker包原创者的博客地址，这样方便以后的学习/复习/解疑//https://guangchuangyu.github.io/cn/tags/chipseeker/    

library(S4Vectors)
library(clusterProfiler)
library(GenomicFeatures)
library(ggplot2)
library(RMariaDB)
library(GenomicRanges)
library(ChIPseeker)
library(ChIPpeakAnno)
library(annotatr)
##################start at there##############################

##useEnsembl to get a TxDb
require(GenomicFeatures)
txdb<-makeTxDbFromGFF("Amphimedon_queenslandica.Aqu1.45.gff3")

gff文件下载与ensemble， 是基因组的注释文件。 

peak <- readPeakFile("larvae1023_peaks.bed")
peak

covplot(file, weightCol="V5")
dev.off()#

#mapping peaks in chr

promoter<-getPromoters(TxDb = txdb, upstream = 3000, downstream = 3000)

tagMatrix<- getTagMatrix(file, window=promoter)

###plot the heatmap of tagMatrix
tagHeatmap(tagMatrix,xlim = c(-3000,3000), color = "red")

###plot the heatmap of peaks align to flank sequences of TSS
peakHeatmap("larvae1023_peaks.bed",
                                weightCol = NULL, 
                                TxDb = txdb,
                                upstream = 3000, downstream = 3000, 
                                xlab = "", ylab = "", title = NULL, 
                                color = "red",
                                verbose = TRUE)
dev.off()
##这两个热图是一样的

###########map two TSS distribution pictures
plotAvgProf(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000), 
            xlab = "Genomic Region (5'->3')", 
            ylab = "Read Count Frequency", 
            conf=0.95, resample=1000)

plotAvgProf(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000), 
            xlab = "Genomic Region (5'->3')", 
            ylab = "Read Count Frequency")
dev.off()

#得到的一个是带阴影的，一个是不带的 TSS 分布图

#接下来是peak的注释

peakAnno <-annotatePeak("larvae1023_peaks.bed", 
                        tssRegion = c(-3000, 3000), 
                        TxDb = txdb, 
                        level = "transcript", 
                        assignGenomicAnnotation = TRUE, 
                        genomicAnnotationPriority = c("Promoter", "5UTR", "3UTR", "Exon", "Intron", "Downstream", "Intergenic"), 
                        annoDb = NULL, 
                        addFlankGeneInfo = FALSE, 
                        flankDistance = 5000, 
                        sameStrand = FALSE, 
                        ignoreOverlap = FALSE, 
                        ignoreUpstream = FALSE, 
                        ignoreDownstream = FALSE, 
                        overlap = "TSS", 
                        verbose = TRUE)

#peak的注释

#接下来是peak注释的可视化

plotAnnoBar(peakAnno)

plotAnnoPie(peakAnno)

vennpie(peakAnno)

upsetplot(peakAnno)

upsetplot(peakAnno, vennpie=TRUE)

#Visualize distribution of TF-binding loci relative to TSS

plotDisToTSS(peakAnno, title="Distribution of transcription factor-binding loci\nrelative to TSS)

 

#接下来是功能富集分析：

Go /KEGG 富集分析

 

############GO enrich  and kegg enrich################################
require(AnnotationHub)
hub <- AnnotationHub()
query(hub, "Amphimedon queenslandica")
aqsponge<-hub[["AH66597"]]  #aqsponge.OrgDb <- hub[["AH10455"]]
length(keys(aqsponge))[1]
columns(aqsponge)

require(clusterProfiler)

#改变ID格式

bitr(keys(aqsponge)[1], 'ENTREZID', c("REFSEQ", "GO", "ONTOLOGY"), aqsponge)
sample_genes <- keys(aqsponge)[1:100]
head(sample_genes)

# still need the "peak.bed"
txdb<- makeTxDbFromGFF("Amphimedon_queenslandica.Aqu1.45.gff3")
peak<-readPeakFile("larvae1023_peaks.bed")
peakAnno <-annotatePeak("larvae1023_peaks.bed",
                        assignGenomicAnnotation = TRUE,
                        tssRegion = c(-3000, 3000),
                        TxDb=txdb,addFlankGeneInfo = TRUE, 
                        flankDistance = 5000)
library(GenomicRanges)

library(dplyr)
as.GRanges(peakAnno) %>% head(3)

###start GO enrich, we need geneID
gene=as.data.frame(peakAnno)$geneId
###Error: operator not defined for this S4 class 
kk<- enrichGO(gene =sample_genes, OrgDb= aqsponge, 
              pvalueCutoff = 0.05,
              qvalueCutoff = 0.05,
              ont="all",
              readable = T)

write.table(kk, file = "GO.txt", sep="\t", quote = F, row.names = F)

两种图表显示

#####bar  
pdf(file="barplot.pdf", width=12, height=7)
barplot(kk, drop=TRUE, showCategory=10, split="ONTOLOGY")+ facet_grid(ONTOLOGY~., scale='free')

####bubble
pdf(file="bubble.pdf",width = 12,height = 7)
dotplot(kk,showCategory = 10,split="ONTOLOGY") + facet_grid(ONTOLOGY~., scale='free')
dev.off()

#同样的进行KEGG分析

  gene =as.data.frame(peakAnno)$geneID
kk<-enrichKEGG(gene = sample_genes, organism="", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05)
write.table(kk, file="KEGG.txt", sep="\t", quote=F,row.names = F )

###bar
pdf("barplotkegg.pdf", width=12, height=7)
barplot(kk, drop=TRUE, showCategory =20)
dev.off()
###bubble
pdf("bubblekegg.pdf", width = 12, height=7)
dotplot(kk, showCategory =20)
dev.off()

 

#接下来就是查找mtif 了。 

首先要将peaks.bed文件转换为fasta文件

在Linux下进行的： 用了bedtools 工具

$ bedtools getfasta -fi Amphimedon_queenslandica.Aqu1.dna.toplevel.fa - bed larvae1023_peaks.bed -fo larvae1023_peaks.fa.out 

这就转换成了fasta文件，然后将文件输入到 MEME suit 网站上进行分析， 选择了meme-chip工具