序列拼接 - Velvet

基因组测序数据的从头组装过程：测序读段（reads) > contig > scaffold > chromosome

1.核心算法

基因组测序数据的从头组装的的核心算法主要可以分为以下几大类：

1. 基于贪婪算法（greedy-extention）(基本淘汰）；

2. 基于Overlap-Layout-Consensus（OLC）（适用于一代测序**）；

3. 基于de Bruijn Graph；

4. 以上两种或多种算法的组合；

5. 其他类型。

6. 结果比较：contig N50, scaffold N50, BUSCO

2. 一般步骤

1. 第一步是数据质控控制 - fastp

2. 第二步，确定起始参数，如K-mer和覆盖率

3. 第三步，使用不同软件进行组装；

4. 第四步，评估组装结果，如contig N50, scaffold N50, 判断是否需要修改参数重新组装。(QUAST和BUSCO)

3. 序列拼接 - velvet

1. Velvet - Current version: 1.2.10

一般工作过程简化为：输入short reads序列 > 排除错误 > 产生高质量的contigs > 用paired-end reads和long reads信息检索contigs之间的重复区域。

2. Velvet下载安装

• 下载velvet的安装包，直接使用make命令来编译，即可获得可执行主程序velveth和velvetg。安装如下：

wget \ 
-O velvet.tgz
http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/velvet_....tgz
tar zxf velvet.tgz
cd velvet.tgz
make 'CATEGORIES=10' 'MAXKMERLENGTH=57'\ 'LONGSEQUENCES=1' 'OPENMP=1' 'BUNDLEDZLIB=1'

参数详解

• CATEGORIES=10： 输入 10 groups of short reads。根据原始数据相应增减该值的大小；值越大，耗内存越大。

• MAXKMERLENGTH=31： 最大的Kmer长度31（默认为 31）。(k-mers一般选择17即可，对于高度重复基因组或者基因组过大，可以选择19甚至31也行。但不是越大越好，kmer越大，越耗内存,而且如果一条reads里有一个错误位点，越大的k-mers就会导致包含这个错误位点的k-mers个数增多)

• BIGASSEMBLY=1： 超过 2.2G 的reads用于组装基因组的时候，需要设置该值。

• LONGSEQUENCES=1： 当contigs长度超过 32kb 长的时候，需要设置该值。

• OPENMP=1：多线程运行。需要设置环境变量 OMP_NUM_THREADS 和 OMP_THREAD_LIMIT。最多为 OMP_NUM_THREADS+1 或 OMP_THREAD_LIMIT 个线程.

• BUNDLEDZLIB=1： velvet默认使用系统自带的zlib，如果系统没有zlib，则需要加入该参数来使用velvet源码包中的zlib.

3. 功能介绍

1. velveth - 准备数据

利用velvet自带的两个脚本程序对每一个pair-end数据进行合并

#fasta 格式
​shuffleSequences_fasta.pl s1_1.fasta s1_2.fasta s1.fasta
    ​
#fastq 格式
shuffleSequences_fastq.pl s1_1.fq s1_2.fq s1.fq

2. 格式化

   代码：./velveth directory/ hash_length

   [-file_format] [-read_type] [filename] [options]

   当有多个文库的时候，按照粗体部分的格式重复写。

   directory：输出文件所在路径的名字（即创建一个文件夹存放结果文件）

   hash_length：也叫k-mer length(起始设定，值越大，内存需求越大)

   filename：标准输入文件名

   Options:

   -strand_specific：转录组序列数据，默认为off

   支持的文件格式：fasta（默认），fastq，fasta.gz，fastq.gz，eland，gerald。

   读类别：short，shortPaired，short2，shortPaired2，long，longPaired。默认为short

例子：

 ./velveth output_directory/ 21 –fasta –short solexa1.fa solexa2.fa solexa3.fa –long capillary.fa 

3. Velvetg - 序列组装

代码：./velvetg directory [options]

directory：工作路径名

Standard options：

-cov_cutoff ：移除低覆盖率的node，默认不移除

#参数名 + 数字，如：
    ./velvetg output_directory/ -cov_cutoff 5.2

-ins_length ：two paired end reads之间的期望距离，默认no read pairing

-read_trkg ：在集合中对short read位置进行跟踪，默认不跟踪

-min_contig_lgth ：导出到contig.fa文件中的最小contig长度，默认为hash长度的2倍

-amos_file ：导出到AMOS文件中，默认不导出（no）

-exp_cov ：唯一区域的期望覆盖率

Advanced options:

-ins_length2 ：两个paired-end reads在第二个short-read数据集中的期望距离，默认否

-ins_length_long ：两个long paired-end reads的期望距离，默认否

-ins_length_sd ：数据集的标准差，默认corresponding length的10%（代表：nothing，2，_long）

-scaffolding ：scaffolding of contigs used paired end information (default: on)-->

-max_pergence ：在一个bubble中的两个分支的最大分歧率，默认0.2-->

-min_pair_count ：构成两个长contigs的paired end的最小值，默认10

-max_coverage ：在tour bus后移除高覆盖率的node

-long_mult_cutoff ：合并contig的long reads的最小值，默认2

-unused_reads ：将不用的reads导出到UnusedReads.fa文件中，默认否

-alignments ：导出一个主要的contig并和参照序列对其，默认否

4. velvetg - 输出结果

• directory/contigs.fa 长度2倍长于kmer的contigs； -scaffolding决定生成的fasta文件是否包含scaffold序列；
• directory/stats.txt - 决定覆盖度cutoff的统计表
• directory/PreGraph - 初始的de vruijin图
• directory/Graph2 - 最终de bruijin图。
• directory/velvet_asm.afg - MOS兼容的文件，能用于AMOS基因组组装软件包
• directory/Log velvet的运行记录