前言
欧易/鹿明生物合作客户安徽农业大学陈国户课题组在International Journal of Molecular Sciences期刊发表的题为 “Comparative Proteomics Indicates That Redox Homeostasis Is Involved in High- and Low-Temperature Stress Tolerance in a Novel Wucai (Brassica campestris L.) Genotype”的研究成果，通过TMT标记定量蛋白质组学和LC-MS/MS蛋白质组学研究方法，发现了乌菜的氧化还原平衡、光合作用、碳水化合物代谢、热休克蛋白和信号转导途径与耐温性有关，验证了维持氧化还原稳态是乌菜新种质耐温性的重要调控通路。
中文标题：比较蛋白质组学表明，在一个新的乌菜基因型中，氧化还原稳态与高低温胁迫的发生有关
英文标题：Comparative Proteomics Indicates That Redox Homeostasis Is Involved in High- and Low-Temperature Stress Tolerance in a Novel Wucai (Brassica campestris L.) Genotype.
研究对象：乌菜
发表期刊：International Journal of Molecular Sciences
影响因子：4.556
合作单位：安徽农业大学
运用欧易/鹿明生物技术：TMT标记定量蛋白质组学（由鹿明生物提供技术支持）、LC-MS/MS蛋白鉴定（由鹿明生物提供技术支持）
研究背景
温度胁迫正成为植物研究中的一个主要问题。低温（LT）和高温（HT）的变化预计将极大地影响酶活性、光合作用、碳同化、DNA/RNA稳定性、膜流动性以及转录和翻译速率。乌菜作为一种不结球白菜（NHCC）产量和食用品质也会受其影响。新基因型WS-1是从乌菜一系列种质中鉴定出来的，它对LT和HT的耐受性高于以往实验中使用的其他基因型。然而，目前尚不清楚哪一种调节途径在热应激反应中起主导作用，也不清楚同一通路是否能改善LT和HT耐受性。
本文作者使用串联质谱标记（TMT）来评估新的NHCC基因型WS-1对LT和HT的反应所发生的分子变化。旨在确定和比较WS-1对LT和HT应激耐受的调控机制。
研究策略
研究结果
1、蛋白质组学定量分析鉴别差异表达蛋白
利用液相色谱-质谱（LC-MS/MS），作者检测了207427张总谱图，50800条肽段、23059条唯一肽段和6831个蛋白质（score sequence HT > 0和 unique peptides ≥ 1）（图1A）。肽段数分布如（图1B）所示，81.3%以上的蛋白质至少含有两条肽段。约99.2%的蛋白质具有大于10 kDa的质量，有很好的覆盖率（图1C）。大于10%和20%的序列覆盖率分布分别为61.2%和41.3%，表明数据质量很高（图1D）。
图1 | 已鉴定蛋白质的鉴定和定量评价
2、低温（LT）组和高温（HT）组共有的DEPs的功能分类
根据（Fold Change >1.2或Fold Change <0.83和p<0.05）筛选标准，共有1732个差异表达蛋白（DEPs）在LT处理中被鉴定，2806个DEPs在HT处理中被鉴定（图2A）。这些上调和下调的DEPs被分为三组：
（1）710个DEPs是对LT组特异性的；
（2）1022个DEPs对LT和HT组都是共同的，包括172个共同上调的蛋白质，324个共同下调的蛋白质，526个不同调节的蛋白质（图2B）；
（3）1784个DEPs对HT组是特异性的。
为了确定WS-1的耐温机制，作者重点研究了在低温和高温条件下调节的1022个DEPs的功能。
图2 | 低温（LT）和高温（HT）处理下温度胁迫响应蛋白的概述
（a）与对照相比，低温和高温处理下乌菜叶片差异表达蛋白的数量；
（b）LT和HT共同调节蛋白（1022蛋白）的分布；
根据GO注释（图3A），这些“共同调节”蛋白质的功能被分配到几个类别，包括生物过程、细胞成分和分子功能。对LT/Cont和HT/Cont处理中常用的1022个DEPs蛋白的生物学过程分析表明，其主要通路是小分子代谢过程和对非生物刺激的反应。大多数受调控的DEPs参与各种分子代谢过程（小分子、氧酸、有机酸、单体、羧酸、硫化合物和一元羧酸），其余的DEPs则参与对刺激的反应。如图3A所示，LT/Cont和HT/Cont处理组相同的是，大多数受调控的DEPs被预测定位于细胞部分、细胞、细胞内部分和细胞质，表明DEPs主要作用于这些细胞成分。HT/Cont处理中，这些DEPs的主要分子功能是RNA结合和蛋白质结合，而在LT/Cont处理中它们是催化活性和RNA结合（图3A）。
为了确定与温度胁迫耐受性相关的代谢通路，根据KEGG数据库进一步分析了1022个DEPs（图3B）。大多数DEPs富集在卟啉和叶绿素代谢、核糖体、次生代谢产物的生物合成、谷胱甘肽代谢、代谢通路、碳代谢、光合生物体的碳固定、2-氧羰基水杨酸代谢、氨基酸生物合成，丙酮酸代谢通路（图3C）。上调的DEPs富集在2-氧羰基水杨酸、光合生物体的碳固定、氨基酸的生物合成和碳水化合物代谢通路上。
图3 | 低温和高温处理下温度胁迫响应蛋白的研究概述
（a）1022个高低温处理下常用调节蛋白的GO分类；
（b）1022个高低温处理下常用调节蛋白的KEGG通路分析；
（c）在每个KEGG通路中，在LT和HT组上调、在LT和HT组下调 和不同调节（一种温度处理后上调，另一种温度处理后下调）的1022个差异调节蛋白的百分比。
3. LT和HT处理中上调的DEPs功能分析
接着作者对共有172个在LT和HT中上调的DEPs进一步进行GO（图4A）和KEGG（图4B）分析。这172个DEPs位于细胞质、叶绿体和质体中，参与了非生物刺激和胁迫的反应，参与了羧酸、氧酸、有机酸和一元羧酸的代谢过程。KEGG通路分析表明，大多数蛋白质在次级代谢产物生物合成和代谢通路中富集（图4B）。后对172个在低温和高温处理中上调的DEPs进行了更详细的本体分析，包括氧化还原稳态、光合作用、碳水化合物代谢、热休克蛋白、信号转导和代谢过程相关的蛋白。
图4 | 在低温和高温处理中上调的172种蛋白质
（a）两种处理下上调蛋白的GO分类柱状图；
（b）172中上调蛋白在每条通路的百分比；
然后作者又使用STRING数据库进行了PPI蛋白互作网络分析，发现谷胱甘肽代谢在所有代谢通路中占主导地位。此外，GLU1与其他代谢过程有直接或间接的相关性，其中主要的代谢过程是SRK2G（P43292）、FOLD4（a0d3dzn5）、RH14（Q8H136）、HSP17.7（M4DG78）、HSP18.1（M4CEA8）、GGT1（a0d3bw42）、BCAT3（Q9M401）、PDIL1-2（Q9SRG3）、ALDH10A8（a0d3cwl2）、ICDH（A0A078FVI0）和P5CSB（M4DE13）（图5）。
图5 | 蛋白互作网络分析
方形：GO/KEGG term；圆点：蛋白质
4. 低温和高温处理上调DEPs相关基因的表达谱分析
为了评估mRNA与蛋白质表达水平的相关性，作者选择了12个与DEPs相关的基因，在LT和HT两种条件下上调，RT-PCR分析。结果表明，LT或HT组的大多数基因表达量均高于对照组。
在LT组中，以下基因的表达较高：RD22、SUS1、P5CSB和CYP38（图6）。与对照组相比，LT和HT处理均能显著提高sHSP17.7、sHSP18.1、ICDH、PSBP1和ERD10的表达水平。这些结果表明，蛋白质的表达模式并不总是与其转录表达模式一致，可能是因为应激相关基因支配了对LT和HT的反应。
图6 | 低温和高温胁迫下植物叶片中与上调差异表达蛋白（DEPs）相关的基因表达
以肌动蛋白（Actin）为内对照，计算其相对表达水平。
5.BccrGLU1在拟南芥中的过表达导致温度胁迫耐受
为了研究氧化还原稳态对植物耐温性的影响，我们构建了表达BccrGLU1的转基因拟南芥（图7a）。RT-PCR结果表明，在选定的转基因植株中，bcrglu1的转录水平被高度诱导，证实植株已经用35S-BccrGLU1:GFP被成功转化（图7B）。在正常生长条件下，野生型（WT）和过表达（OE）转基因株系之间没有明显的表型差异，表明BccrGLU1的过表达不会导致转基因拟南芥幼苗的表型缺陷。在OE株系中，铁氧还蛋白（FD）-GOGAT活性在正常条件下显著高于WT（图7C）。
为了评价BccrGLU1的作用，对三个OE株系进行了生理学分析。在正常条件下，OE株系谷胱甘肽（GSH）含量高于WT系。在低温和高温下，三种过表达植物（OE#1、OE#2和OE#7）的GSH水平显著高于野生型植物（图7D）。正常条件下的OE株系的GSH/氧化谷胱甘肽(GSSG)比值与WT无差异，而温度胁迫下的OE株系的GSH/氧化谷胱甘肽比值明显高于WT植株(图7E)。
图7 | 35S-BccrGLU1:GFP融合蛋白的构建及与拟南芥野生型（WT）和过表达（OE）系温度胁迫反应相关的生理变化示意图
（a）35S-ccrGLU1:GFP融合蛋白构建示意图；
（b）BccrGLU1在T3转基因植株中的相对表达；
（c）Fd-GOGAT在WT和OE中的活性；
（d）叶片中谷胱甘肽（GSH）的含量；
（e）谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽（GSSG）比值
另外，作者通过确定在温度胁迫下的氧化损伤参数，以评估在OE株系的氧化还原稳态。在正常条件下，OE株系的MDA含量和电解质渗漏量与WT系无显著差异。当OE株系暴露于LT和HT时，其MDA含量和电解质渗漏量均低于WT系（图8A、B）。在正常条件下，三个OE系的脯氨酸含量略高于WT系，并且OE系的脯氨酸含量比WT系对LT和HT的反应更高（图8C）
图8 | 拟南芥WT和OE系的氧化损伤和脯氨酸含量
（a）拟南芥幼苗丙二醛含量；
（b）拟南芥幼苗电解质渗漏；
（c）拟南芥幼苗脯氨酸含量；
染色模式显示，与WT相比，OE系在胁迫下的ROS水平较低（图9A）。与野生型相比，OE席的过氧化氢（H2O2）含量和O2生成速率也降低，这与染色模式（图9B，C）一致。这些结果表明，BCCRGLU1与活性氧清除相关，以对抗氧化应激。
图9 | 拟南芥WT和OE株系的氧化损伤
（a）用硝基蓝四唑（NBT）和过氧化氢（H2O2）在上排中进行组织化学染色法测定，在下排用DAB染色；
（b）氧气含量的定量；
（c）过氧化氢含量的定量；
相关讨论
图10 | 对LT和HT处理都响应的上调WS-1蛋白示意图
红边表示上调的蛋白质，箭头表示正调节，T形条表示负调节
TMT标记定量蛋白质组学分析表明，WS-1的耐温性可能与多种因素有关，包括稳定的氧化还原内环境、完整的析氧复合物、渗透压的积累、sHSPs和伴侣的诱导以及代谢过程的增强。
研究者推断，对LT和HT应激的耐受性涉及一个共同的调节通路，DEPs的表达增加，包括Fe-GOGAT、BADH、P5CS、GGT和AOX，有助于调节氧化还原稳态（图10）。为了进一步证实氧化还原稳态的作用，研究者在拟南芥中过度表达了BccrGLU1。在LT和HT胁迫下，35S:BCCRGl1植物的GSH含量和GSH/GSSG比值均比WT低，且与WS-1比较蛋白质组学数据一致。结合这些数据，发现氧化还原稳态在提高WS-1细胞对LT和HT胁迫的耐受性方面发挥了重要作用。
研究结论
在本研究中，我们采用串联质谱（TMT标记定量蛋白组学）结合液相色谱-质谱（LC-MS/MS质谱鉴定）的蛋白质组学方法，鉴定了1022种经LT或HT处理的WS-1共有的差异表达蛋白（DEPs）。在1022个DEPs中，172个对LT和HT都有上调反应，324个对LT和HT都有下调反应，526个对一种温度胁迫有上调反应，对另一种温度胁迫有下调反应。为了阐明WS-1的共同调控通路[P3] ，作者进一步分析了172个上调的DEPs。结果表明，乌菜的氧化还原平衡、光合作用、碳水化合物代谢、热休克蛋白、伴侣和信号转导途径与耐温性有关。此外，35S:BCCRCRGL1在拟南芥中过表达，在温度胁迫下，谷胱甘肽（GSH）含量降低，谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值降低，氧化损伤减少。这一结果与氧化还原稳态相关蛋白的动态调节一致。这些数据表明，维持氧化还原稳态是乌菜新种质耐温性的重要调控通路。
参考文献：
Yuan L , Wang J , Xie S , et al. Comparative Proteomics Indicates That Redox Homeostasis Is Involved in High- and Low-Temperature Stress Tolerance in a Novel Wucai (Brassica campestris L.) Genotype[J]. International Journal of Molecular ences, 2019, 20(15):3760.
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文章来源于鹿明生物