R实战 | 用R也可以完成的RNA-Seq分析-2

Pre-processing

本文将要介绍的是在R中进行RNA-seq 数据预处理的实战代码

原文地址:https://bioinformatics-core-shared-training.github.io/RNAseq-R/rna-seq-preprocessing.nb.html

主要包括以下方面:

  1. 载入mapping, counting后的数据

  2. 过滤低表达基因

  3. 对表达数据进行质量控制

  4. 标准化处理

本次流程需要的包

library(edgeR)
library(limma)
library(Glimma)
library(gplots)
library(org.Mm.eg.db)
library(RColorBrewer)
  • 温馨提示:org.Mm.eg.db有60多M,个人推荐没有安装过的朋友先切换到国内的镜像,再下载这个包。
options(repos = 'https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/')
getOption('repos')
BiocManager::install('org.Mm.eg.db')

另外,本次所需要的数据均可以在该网站下载:https://figshare.com/s/1d788fd384d33e913a2a

下载的数据有:

  • Sampleinfo.txt
  • GSE60450_Lactation-GenewiseCounts.txt
  • mouse_c2_v5.rdata
  • mouse_H_v5.rdata

载入数据

首先,我们读入样本信息"SampleInfo.txt"

> sampleinfo <- read.delim("data/SampleInfo.txt")
> sampleinfo
                            FileName SampleName CellType   Status
1  MCL1.DG_BC2CTUACXX_ACTTGA_L002_R1    MCL1.DG  luminal   virgin
2  MCL1.DH_BC2CTUACXX_CAGATC_L002_R1    MCL1.DH    basal   virgin
3  MCL1.DI_BC2CTUACXX_ACAGTG_L002_R1    MCL1.DI    basal pregnant
4  MCL1.DJ_BC2CTUACXX_CGATGT_L002_R1    MCL1.DJ    basal pregnant
5  MCL1.DK_BC2CTUACXX_TTAGGC_L002_R1    MCL1.DK    basal  lactate
6  MCL1.DL_BC2CTUACXX_ATCACG_L002_R1    MCL1.DL    basal  lactate
7  MCL1.LA_BC2CTUACXX_GATCAG_L001_R1    MCL1.LA    basal   virgin
8  MCL1.LB_BC2CTUACXX_TGACCA_L001_R1    MCL1.LB  luminal   virgin
9  MCL1.LC_BC2CTUACXX_GCCAAT_L001_R1    MCL1.LC  luminal pregnant
10 MCL1.LD_BC2CTUACXX_GGCTAC_L001_R1    MCL1.LD  luminal pregnant
11 MCL1.LE_BC2CTUACXX_TAGCTT_L001_R1    MCL1.LE  luminal  lactate
12 MCL1.LF_BC2CTUACXX_CTTGTA_L001_R1    MCL1.LF  luminal  lactate

再读入基因计数后的数据"GSE60450_Lactation-GenewiseCounts.txt"

> seqdata <- read.delim("data/GSE60450_Lactation-GenewiseCounts.txt",
+                       stringsAsFactors = FALSE)
> head(seqdata)
  EntrezGeneID Length MCL1.DG_BC2CTUACXX_ACTTGA_L002_R1 MCL1.DH_BC2CTUACXX_CAGATC_L002_R1
1       497097   3634                               438                               300
2    100503874   3259                                 1                                 0
3    100038431   1634                                 0                                 0
4        19888   9747                                 1                                 1
5        20671   3130                               106                               182
6        27395   4203                               309                               234
  MCL1.DI_BC2CTUACXX_ACAGTG_L002_R1 MCL1.DJ_BC2CTUACXX_CGATGT_L002_R1
1                                65                               237
2                                 1                                 1
3                                 0                                 0
4                                 0                                 0
5                                82                               105
6                               337                               300
  MCL1.DK_BC2CTUACXX_TTAGGC_L002_R1 MCL1.DL_BC2CTUACXX_ATCACG_L002_R1
1                               354                               287
2                                 0                                 4
3                                 0                                 0
4                                 0                                 0
5                                43                                82
6                               290                               270
  MCL1.LA_BC2CTUACXX_GATCAG_L001_R1 MCL1.LB_BC2CTUACXX_TGACCA_L001_R1
1                                 0                                 0
2                                 0                                 0
3                                 0                                 0
4                                10                                 3
5                                16                                25
6                               560                               464
  MCL1.LC_BC2CTUACXX_GCCAAT_L001_R1 MCL1.LD_BC2CTUACXX_GGCTAC_L001_R1
1                                 0                                 0
2                                 0                                 0
3                                 0                                 0
4                                10                                 2
5                                18                                 8
6                               489                               328
  MCL1.LE_BC2CTUACXX_TAGCTT_L001_R1 MCL1.LF_BC2CTUACXX_CTTGTA_L001_R1
1                                 0                                 0
2                                 0                                 0
3                                 0                                 0
4                                 0                                 0
5                                 3                                10
6                               307                               342
> dim(seqdata)   # 数据包含了27179行的基因信息,1列ID、1列基因长度和12列的样本数据
[1] 27179    14

由于我们关注的是基因计数的信息,因此为了方便下游分析处理,我们移除seqdata中前两列,并将第一列的ID命名为行名

> countdata <- seqdata[,-(1:2)]
> rownames(countdata) <- seqdata[,1]
> head(countdata)
          MCL1.DG_BC2CTUACXX_ACTTGA_L002_R1 MCL1.DH_BC2CTUACXX_CAGATC_L002_R1
497097                                  438                               300
100503874                                 1                                 0
100038431                                 0                                 0
19888                                     1                                 1
20671                                   106                               182
27395                                   309                               234
          MCL1.DI_BC2CTUACXX_ACAGTG_L002_R1 MCL1.DJ_BC2CTUACXX_CGATGT_L002_R1
497097                                   65                               237
100503874                                 1                                 1
100038431                                 0                                 0
19888                                     0                                 0
20671                                    82                               105
27395                                   337                               300
          MCL1.DK_BC2CTUACXX_TTAGGC_L002_R1 MCL1.DL_BC2CTUACXX_ATCACG_L002_R1
497097                                  354                               287
100503874                                 0                                 4
100038431                                 0                                 0
19888                                     0                                 0
20671                                    43                                82
27395                                   290                               270
          MCL1.LA_BC2CTUACXX_GATCAG_L001_R1 MCL1.LB_BC2CTUACXX_TGACCA_L001_R1
497097                                    0                                 0
100503874                                 0                                 0
100038431                                 0                                 0
19888                                    10                                 3
20671                                    16                                25
27395                                   560                               464
          MCL1.LC_BC2CTUACXX_GCCAAT_L001_R1 MCL1.LD_BC2CTUACXX_GGCTAC_L001_R1
497097                                    0                                 0
100503874                                 0                                 0
100038431                                 0                                 0
19888                                    10                                 2
20671                                    18                                 8
27395                                   489                               328
          MCL1.LE_BC2CTUACXX_TAGCTT_L001_R1 MCL1.LF_BC2CTUACXX_CTTGTA_L001_R1
497097                                    0                                 0
100503874                                 0                                 0
100038431                                 0                                 0
19888                                     0                                 0
20671                                     3                                10
27395                                   307                               342

另外,我们注意到countdata中的列名过于冗长,而样本信息中的名字也只是前7位字母而已,因此我们使用substr()函数截取列名

> sampleinfo$SampleName
 [1] MCL1.DG MCL1.DH MCL1.DI MCL1.DJ MCL1.DK MCL1.DL MCL1.LA MCL1.LB MCL1.LC MCL1.LD MCL1.LE MCL1.LF
12 Levels: MCL1.DG MCL1.DH MCL1.DI MCL1.DJ MCL1.DK MCL1.DL MCL1.LA MCL1.LB MCL1.LC ... MCL1.LF

> colnames(countdata)
 [1] "MCL1.DG_BC2CTUACXX_ACTTGA_L002_R1" "MCL1.DH_BC2CTUACXX_CAGATC_L002_R1"
 [3] "MCL1.DI_BC2CTUACXX_ACAGTG_L002_R1" "MCL1.DJ_BC2CTUACXX_CGATGT_L002_R1"
 [5] "MCL1.DK_BC2CTUACXX_TTAGGC_L002_R1" "MCL1.DL_BC2CTUACXX_ATCACG_L002_R1"
 [7] "MCL1.LA_BC2CTUACXX_GATCAG_L001_R1" "MCL1.LB_BC2CTUACXX_TGACCA_L001_R1"
 [9] "MCL1.LC_BC2CTUACXX_GCCAAT_L001_R1" "MCL1.LD_BC2CTUACXX_GGCTAC_L001_R1"
[11] "MCL1.LE_BC2CTUACXX_TAGCTT_L001_R1" "MCL1.LF_BC2CTUACXX_CTTGTA_L001_R1"
> colnames(countdata) <- substr(colnames(countdata), 1, 7)
> colnames(countdata)
 [1] "MCL1.DG" "MCL1.DH" "MCL1.DI" "MCL1.DJ" "MCL1.DK" "MCL1.DL" "MCL1.LA" "MCL1.LB" "MCL1.LC"
[10] "MCL1.LD" "MCL1.LE" "MCL1.LF"
> table(colnames(countdata)==sampleinfo$SampleName)  #使用table函数检验修改后的名字与原名字是否相同

TRUE 
  12 

数据过滤

对于表达量过低的基因而言,其数据在差异分析中的可信度是较差的。因此,在本流程中我们先使用edgeRcpm()函数,将counting后的数据转换为CPM(counts-per-million),并取CPM在两个重复样本中均大于0.5的基因进入后续分析。

> myCPM <- cpm(countdata)
> head(myCPM)
              MCL1.DG     MCL1.DH     MCL1.DI     MCL1.DJ   MCL1.DK    MCL1.DL    MCL1.LA
497097    18.85684388 13.77543859  2.69700983 10.45648006 16.442685 14.3389690  0.0000000
100503874  0.04305215  0.00000000  0.04149246  0.04412017  0.000000  0.1998463  0.0000000
100038431  0.00000000  0.00000000  0.00000000  0.00000000  0.000000  0.0000000  0.0000000
19888      0.04305215  0.04591813  0.00000000  0.00000000  0.000000  0.0000000  0.4903857
20671      4.56352843  8.35709941  3.40238163  4.63261775  1.997275  4.0968483  0.7846171
27395     13.30311589 10.74484210 13.98295863 13.23605071 13.469996 13.4896224 27.4615975
             MCL1.LB    MCL1.LC     MCL1.LD    MCL1.LE    MCL1.LF
497097     0.0000000  0.0000000  0.00000000  0.0000000  0.0000000
100503874  0.0000000  0.0000000  0.00000000  0.0000000  0.0000000
100038431  0.0000000  0.0000000  0.00000000  0.0000000  0.0000000
19888      0.1381969  0.4496078  0.09095771  0.0000000  0.0000000
20671      1.1516411  0.8092940  0.36383085  0.1213404  0.4055595
27395     21.3744588 21.9858214 14.91706476 12.4171715 13.8701357

> thresh <- myCPM > 0.5  # This produces a logical matrix with TRUEs and FALSEs
> head(thresh)
          MCL1.DG MCL1.DH MCL1.DI MCL1.DJ MCL1.DK MCL1.DL MCL1.LA MCL1.LB MCL1.LC MCL1.LD MCL1.LE
497097       TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE
100503874   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE
100038431   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE
19888       FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE   FALSE
20671        TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE   FALSE   FALSE
27395        TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE    TRUE
          MCL1.LF
497097      FALSE
100503874   FALSE
100038431   FALSE
19888       FALSE
20671       FALSE
27395        TRUE

table()函数每个基因(每行)在几个样本中是符合条件的

> table(rowSums(thresh))

    0     1     2     3     4     5     6     7     8     9    10    11    12 
10857   518   544   307   346   307   652   323   547   343   579   423 11433 
#可以发现有11433个基因在12个样本中CPM均大于0.5 

随后,保留至少在两个样本符合条件的基因。

> keep <- rowSums(thresh) >= 2

# Subset the rows of countdata to keep the more highly expressed genes
> counts.keep <- countdata[keep,]
> summary(keep)
   Mode   FALSE    TRUE 
logical   11375   15804 
> dim(counts.keep)
[1] 15804    12

我们保留了15804个相对表达可信的基因。至于,counts threshold的选择可以参考原文:

As a general rule, a good threshold can be chosen by identifying the CPM that corresponds to a count of 10, which in this case is about 0.5. You should filter with CPMs rather than filtering on the counts directly, as the latter does not account for differences in library sizes between samples.

创建表达矩阵

接着我们使用edgeRDGEList函数来创建表达矩阵

 # 将counts 转换为 DGEList 对象
> dgeObj <- DGEList(counts.keep)
> dgeObj
An object of class "DGEList"
$counts
       MCL1.DG MCL1.DH MCL1.DI MCL1.DJ MCL1.DK MCL1.DL MCL1.LA MCL1.LB MCL1.LC MCL1.LD MCL1.LE
497097     438     300      65     237     354     287       0       0       0       0       0
20671      106     182      82     105      43      82      16      25      18       8       3
27395      309     234     337     300     290     270     560     464     489     328     307
18777      652     515     948     935     928     791     826     862     668     646     544
21399     1604    1495    1721    1317    1159    1066    1334    1258    1068     926     508
       MCL1.LF
497097       0
20671       10
27395      342
18777      581
21399      500
15799 more rows ...

$samples
        group lib.size norm.factors
MCL1.DG     1 23218026            1
MCL1.DH     1 21768136            1
MCL1.DI     1 24091588            1
MCL1.DJ     1 22656713            1
MCL1.DK     1 21522033            1
7 more rows ...

 # 看看 dgeObj 中保存了什么信息
> names(dgeObj)
[1] "counts"  "samples"

根据CellType和小鼠的Status,我们可以创建分组信息。

group <- paste(sampleinfo$CellType,sampleinfo$Status,sep=".")
group <- factor(group)

质量控制

由于我们的数据并不是正态分布的,为了下游分析的进行,使用cpm函数对我们的数据取log2处理

> logcounts <- cpm(dgeObj,log=TRUE)
> # 使用箱线图检查数据的分布
> boxplot(logcounts, xlab="", ylab="Log2 counts per million",las=2)
> # 使用蓝色的横线标出logCPM的中值
> abline(h=median(logcounts),col="blue")
> title("Boxplots of logCPMs (unnormalised)")
R实战 | 用R也可以完成的RNA-Seq分析-2_第1张图片

从箱线图中可以看出样本数据分布虽然存在差异,但这种差异程度是我们还能接受的程度。

主成分分析

主成分分析在RNA-seq分析中是一个较为重要的步骤,其指出了样本数据中造成主要差异的因子是什么。一般而言,我们当然希望数据中最大的差异是由于处理与否引起的

> plotMDS(dgeObj)
R实战 | 用R也可以完成的RNA-Seq分析-2_第2张图片
可以看到两个生物学重复样本都能较好的聚在一起

可以看到两个生物学重复样本都能较好的聚在一起

另外,我们也可以运用各种参数使主成分分析的可视化更加符合我们的要求,例如根据细胞类型或小鼠状态标注颜色:


R实战 | 用R也可以完成的RNA-Seq分析-2_第3张图片
根据细胞类型或生理状态来丰富主成分分析图

总而言之,利用主成分分析,可以观察出引起样本变化的主要因子。

标准化处理

此处我们采用了The trimmed mean of M-values normalization method (TMM) 去校正文库之间的组成偏好。

> dgeObj <- calcNormFactors(dgeObj)
> dgeObj$samples
        group lib.size norm.factors
MCL1.DG     1 23218026    1.2368993
MCL1.DH     1 21768136    1.2139485
MCL1.DI     1 24091588    1.1255640
MCL1.DJ     1 22656713    1.0698261
MCL1.DK     1 21522033    1.0359212
MCL1.DL     1 20008326    1.0872153
MCL1.LA     1 20384562    1.3684449
MCL1.LB     1 21698793    1.3653200
MCL1.LC     1 22235847    1.0047431
MCL1.LD     1 21982745    0.9232822
MCL1.LE     1 24719697    0.5291015
MCL1.LF     1 24652963    0.5354877
# 此步在‘samples’信息中直接添加了校正因子。

我们可以单独抽一个样本出来看看校正前后的数据分布情况


R实战 | 用R也可以完成的RNA-Seq分析-2_第4张图片

可以看出校正后,样本表达更加集中于0。

至此,数据的预处理也已经完结,文中的可视化部分仅是为了辅助我们查看数据与方便我们的学习,在实战中,部分数据预处理时的可视化也可省略。

#保存预处理分析结果
save(group,dgeObj,sampleinfo,file="~preprocessing.Rdata")

暂完。

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