原创 montreal 生信人 2018-08-01（本篇preprin目前已发表于PNAS https://www.pnas.org/content/116/15/7409/tab-article-info）
在开始今天的话题之前，先让我们来聊几个生物界之最。我们知道，最大的陆生动物是非洲象，高可达四米，重达10吨。最大的海洋动物是蓝鲸，长30余米，重达180吨。最大的植物是巨杉，体积有1,489立方米（以上数据来自维基）。然而，对于作为生物界的重要组成的真菌（fungi），人类对于他们的大小知之甚少，对其体积大小的决定机制更是所知有限。简言之，这个问题就是：How much room is needed for fungi to grow?（真菌的生长需要多大的空间）
日前，来自匈牙利科学院等单位的科学家们在bioRxiv上刊载文章，通过转录组学和基因组学的手段对前面提到的问题进行了探讨：Transcriptomic atlas of mushroom development highlights an independent origin of complex multicellularity (1)。这里提醒大家一下，截止小编发稿为止，本文尚未发表，其共享遵循CC-BY-ND 4.0版权。
大家知道真核生物与原核生物一个重要区别在于真核生物中有许多多细胞（multi-cellular）生物。有趣的是，多细胞结构被认为是多次独立起源的：除了动植物外，在真菌（fungi）中也有多细胞生物存在。这类多细胞真菌也就是大家熟知的蘑菇。在分类学上，蘑菇分属于伞菌门（Agaricomycetes）和担子菌门（Basidiomycota）。
BY THE WAY：其实对于这个问题，读生物学的行内人可能倒不如非生物专业的行外人反应快。行外人可能立即可以想到蘑菇，而生物人对于真菌的印象往往局限于酿酒酵母或裂殖酵母这两种经典模式生物。小编曾和本文的通讯作者László Nagy有过一次交流的机会，记得Nagy对小编说酿酒酵母对于真菌的研究并不是很好的代表（然而小编并不理解这句话的意义）。虽然年纪轻轻，这位来自匈牙利小城赛盖德（Szeged）的学者已是真菌基因组学领域的翘楚。
为了研究蘑菇为何与其他真菌不同可以长这么大，研究人员对六种蘑菇的子实体（fruiting body）的不同发育阶段进行转录组分析。子实体，也就是蘑菇露出地面的最耀眼的部分（如下图所示），它的出现，标志着蘑菇由简单转向复杂的多细胞状态。
这六种蘑菇分别是Coprinopsis cinereaAmutBmut, Schizophyllum commune H4-8, Phanerochaete chrysosporiumRP78, Rickenella mellea SZMC22713, Lentinus tigrinus RLG9953-sp，以及Armillaria ostoyae C18/9。这其中，除了最后一个取自Nagy团队早前的研究之外(2)，其余都是作者们这次新进行的转录组测序。让我们一睹六种蘑菇的芳容先：
由左至右：Coprinopsis cinerea灰盖鬼伞 Schizophyllum commune裂褶菌 Phanerochaete chrysosporium黄孢原毛平革菌
由左至右：Rickenella mellea瘦脐菇，Lentinus tigrinus 香菇，Armillaria ostoyae蜜环菌（大部分是地下部分，图为PS）
根据每种蘑菇的特点和实际情况，作者对每种蘑菇取3-9个发育阶段进行转录组测序。每个发育阶段包含三个重复，加在一起超过120个library。问题来了，作者为何对不同的蘑菇选取不同的发育阶段进行转录组测序？针对这一问题，作者在文中表示：it is difficult to align intermediate developmental stages across species。但他们同时表示尽力使得不同蘑菇转录组之间的可比性最大化。
作者们针对六种蘑菇的转录组分析表明大致有12,003 - 17,822个表达基因，其中大约938-7,605个基因在不同发育阶段有着不同的调控（developmentally regulated）。这其中，有188-1856个基因在子实体形成的起始阶段上调表达（upregulation）。这一阶段也是蘑菇向复杂多细胞阶段过渡的开始。作者所用的判断translationally regulated genes的标准是：Developmentally regulated transcripts (i.e. those that show FDR<0.05 in edger and FC>4 across any two developmental stages and FPKM>4（小编窃以为该标准稍显主观，不清楚这一标准是否会对下面的结论有严重影响）。
作者通过GO（gene ontology）分析，发现在六种蘑菇的子实体的发育阶段普遍性地被developmentally regulated genes的功能富集（enriched）在以下几个类别：细胞壁重建（cell wall remolding），氧化还原酶活性，碳水化合物代谢，以及DNA复制、跨膜糖转运、核糖体、脂类合成等方面。此外，作者采用Short Time Series Expression Miner（STEM）对developmentally regulated genes的共表达情况进行了归类，最后得到28-40个模块（modules）（不同蘑菇的模块数目有所不同）。这其中，最大的模块包含的基因主要集中在子实体形成的起始阶段。联系子实体的发育需要不断细胞分裂增殖和细胞壁瓦解再重建，这些富集的基因功能也就不难理解了。此外，作者发现根据功能注释和extracellular secretion signal的分析，发现许多富集在developmentally regulated genes的基因编码潜在的外分泌蛋白——这和蘑菇子实体成长过程中涉及到的细胞细胞间相互沟通不谋而合。作者在文中对以上基因的功能有着详细的讨论，由于篇幅所限这里不再赘述。
Fig.1a from (1)。FB：子实体，FB-init：子实体形成初期
作者接下来采用phylostratigraphic profile的方法，对developmentally regulated genes的进化历程进行了分析（下图）。他们意外地发现，这些基因的大多数早在真菌出现之间，真核生物起源之初，甚至可能在生命之初就已出现——因为这些基因广泛分布于各种生物之中（下图）。作者认为，是这些较为远古时期起源的基因——而非蘑菇特异基因（mushroom-specific genes）——主要参与到了子实体发育这一蘑菇特有的生命活动中来。用作者的话就是：Most developmental gene families are older than fruiting body formation。其实小编认为这一点十分有趣，可惜的是作者在这里着笔墨很少，并未深究。
Fig 1d from (1)
到这里，作者似乎意犹未尽。转录组分析虽然好，但相比于已有的真菌基因组数据来讲，还是显得太少了，毕竟前者只有六种蘑菇。因此，作者接下来集结了201个真菌基因组，在基因组层面对蘑菇特异（mushroom-specific）的基因进行了鉴定。这里的基本思想就是，找寻在不同的蘑菇基因组中富集的基因。通俗地说，蘑菇高拷贝数，而非蘑菇基因低拷贝数的 基因。
这一大规模比较基因组分析发现了蘑菇基因组中显著扩增的基因主要包括多种E3连接酶（F-box，RING-type zinc finger，BTB/POZ，见下图）、转录因子，以及参与cell communication和adhesion等活动的基因。大家都知道E3连接酶是蛋白酶体降解蛋白中底物特异性的决定者，而子实体发育又是一个不停推倒重建的动态过程，因此E3连接酶在基因组层面上的扩增和多样化（expansion and diversification）可能对于蘑菇的发育有着重要贡献。同样地，子实体发育中可能涉及的更加复杂而精细的转录调控也有赖于许多转录因子家族的扩增和功能分化。作者还对蘑菇中的情况同动物、植物和褐藻（brown algae，比如海带）等多细胞生物进行了比较，发现基因组层面上的不少多细胞起源与进化的殊途同归的相似机制。
Fig 4a from (1)
总体上说，本文作者通过大规模的comparative transcriptomics and genomics分析，对蘑菇子实体发育——这一有别于其他真菌的重要特征——进行了系统的剖析，为研究多细胞起源与进化提供了重要线索。当然，可能是因为所研究的问题较为复杂，本文的结构似乎有些凌乱，行文也有冗余的痕迹。这或许也是预印本（preprint）的缘故。但预印本作为科学家们的创作草稿，特别是同以后发表的正文对照，也恰恰可以反映出科学研究过程中的某些稍显“青涩”的思路以及如何在日后经过同行评议得到提升，其中一定有值得借鉴的地方。
就在Nagy团队bioRxiv文章刊载不久，来自云南农业大学等多家单位的科学家们在Nature旗下的Scientific Reports上发表文章报道了90个蘑菇基因组的draft genome assembly(3)，可以说这是蘑菇基因组乃至真核生物基因组一次重要的genome release。这些资源，相信会为真菌基因组学和多细胞起源等问题的研究做出重要贡献。
最后，回到文章开头的问题，How much room is needed for fungi to grow？根据维基的资料，生活在美国俄勒冈州(Oregon)的一株2400岁高龄的Armillaria solidipes占地面积可达8.8平方公里，堪称世界上最大的生物！所以，Howmuch room is needed for fungi to grow? As mushroom (谐音:much room) as possible.
引文
1.Krizsan K, Almasi E, Merenyi Z, Sahu N, Viragh M, Koszo T, et al. Transcriptomic atlas of mushroom development highlights an independent origin of complex multicellularity. bioRxiv. 2018.
2.Sipos G, Prasanna AN, Walter MC, O'Connor E, Balint B, Krizsan K, et al. Genome expansion and lineage-specific genetic innovations in the forest pathogenic fungi Armillaria (vol 1, pg 1931, 2017). Nat Ecol Evol. 2018;2(3):577-.
3.Li HY, Wu SR, Ma X, Chen W, Zhang J, Duan SC, et al. The Genome Sequences of 90 Mushrooms. Sci Rep-Uk. 2018;8.
作者原创，原载于生信人微信公众号