ATAC-Seq Protocol for Buck Cell

ATAC-Seq Protocol for Buck Cell
版权说明：(XMU_Zhang_Lab, V-2019-03-23, 特别致谢：刘俊佳 /边成林同学）

参考资料：
- 基本原理
- 其他实验室的 P
材料准备
- 1. 转座酶试剂:TruePrepTM DNALibrary Prep Kit V2 for Illumina®（Vazyme TD501/TD502/503）
  - TD501->>500 ng DNA, ATAC, 3000-30000 cells
  - TD502: -> 50 ng DNA, 20-> 2000 cells
  - TD503: -> 5 ng DNA
- 2 .建库接头
  - 单端96种接头：TruePrepTM Index Kit V4 for Illumina® (VazymeTD204/TD205/TD206/TD207)
  - 双端96种接头：TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina® (Vazyme TD202)
  - 双端384种接头：TruePrepTM Index Kit V3 for Illumina®(Vazyme TD203)
- 3. 磁珠: VAHTS DNA CleanBeads(Vazyme N411)
- 4. 其他: 台盼蓝、PCR仪、离心机、磁力架、低吸附EP管、PCR管、无水乙醇、Qubit 试剂
- 5. 裂解液
  - 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2，0.1% NP-40
  - 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2，0.1% NP-40, 0.02% digitonin （效果更好）
  - （不同的细胞适用的去污剂的类型和浓度有所差异，较强的裂解液会影响调控区域的打开
  - 与关闭，裂解强度不够则影响细胞破裂，影响酶进入到细胞核内，实验前需摸索最适裂解液浓度。）
- 6. Library QC primers and PCR reagent
  - Primers:
    - GAPDH CATCTCAGTCGTTCCCAAAGT TTCCCAGGACTGGACTGT
    - Gene desert1 AACTGGCTAGTAAGGAGTGAATG GGAAAGTCCCTCTCTCTAACCT
    - B2M GGGAATGGAAAGAAGTCCACTAT GCGACGCCTCCACTTATATT
    - Gene desert2 CCCAAACTCTGAGAGGCTTATT GAGCCATCATCTAGACACCTTC
  - Q5 based qPCR reagents: Q5 hostart enzyme (NEB), Sybgreen/Evagreen real-time pcr Dye( Invitrogen)
步骤：
- 1. 细胞收集
  - 1、500×g，4℃离心5 min 收集细胞，弃上清，PBS 将细胞沉淀重悬。
  - 2、血球计数板计数。细胞活性可用0.4%台盼蓝染色鉴定。（活率要在90%以上）
  - 3、取含有30000个单细胞的悬液，500×g，4℃离心5 min 收集细胞，弃上清。
  - 4、弃上清，用 50μl 预冷的Lysis buffer 重悬细胞，冰上放置10 min 裂解细胞。
  - 5、在4℃下，500×g 离心5 min 收集细胞核。弃上清，置于冰上。
  - （在细胞聚集的管壁方向做好标记，吸取上清时，在沉淀对立面轻轻吸取液体）。
- 2. 转座酶打断
  - 组份 TD502
  - 1).在PCR管中配制如下打断Mix：
    - 5×TTBL 4 μl
    - TTEMix V50 5 μl
    - ddH2O 11 μl
    - 总体积 20 μl
  - 1. 轻轻吹打混匀，短暂离心。
  - 1. 将反应管置于PCR仪中，进行如下反应：
    - 温度时间
    - 37℃ 30min
    - 4℃ Hold
- 3.片段化产物纯化
  - 1. 将 VAHTS DNA Clean Beads 从4℃取出，室温放置30 min，使用前涡旋混匀，再用2×的磁珠纯化酶切产物，用TD502，加40 μl磁珠到反应体系，吹打10次（磁珠与体系充分混合均匀）。
  - （注：磁珠比较粘稠，用移液枪确保取到足够的体积并缓慢打出。）
  - 2.室温孵育5 min。
  - 1. 将反应管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。
  - 1. 保持PCR管在磁力架上，待溶液澄清（约5 min），小心弃去上清，不要扰到磁珠。
  - 1. 保持PCR管在磁力架上，加入200 μl新鲜配制的80%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30 sec后小心移除上清。
  - 1. 重复步骤5，总共漂洗两次，轻轻离心，用白色小枪头吸干乙醇。
  - 1. 开盖干燥2.5 min左右。（磁珠刚好晾干，表面无光泽即可，不要让磁珠干裂）
  - 1. 磁珠晾干后，将 PCR 管从磁力架上取出，加入 26μl 双蒸水到PCR管中覆盖磁珠，吹打混匀磁珠。
  - 1. 室温孵育2 min。
  - 1. 将 PCR 管短暂离心收集置于磁力架中分离磁珠和液体，直到溶液澄清（约5 min）。
  - 1. 小心吸取24μl上清转移到新的EP管中。
- 1. PCR富集
  - 1. 在RNA RNase Free的 PCR 管中配制以下组分：
    - [图片上传失败...(image-2531fa-1561461961488)]
    - 注：若购买 TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina® (Vazyme #TD202)的引物，则对应的 P5 Primer X 为 N501，P7 Primer X对应为 N7XX（对应每个样品记住序号）。
  - 2、使用移液器轻轻吹打混匀，在PCR仪中进行如下反应：
    - [图片上传失败...(image-12645f-1561461961488)]
- 5. PCR 产物纯化
  - 1. ```
      涡旋 VAHTS DNA Clean Beads 使其充分混匀，加 60μl（1.2 x）VAHTS DNA Clean Beads 到上述PCR反应体系中（吹吸混匀10次保证整个体系均匀）。
```
- （注：磁珠比较粘稠，用移液枪确保取到足够的体积并缓慢打出。）
- 1. ```
    室温孵育5 min。
```
  - 1. ```
      将反应管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。
```
- 1. ```
    保持PCR管在磁力架上，待溶液澄清（约5 min），弃去上清，注意不要扰到磁珠。
```
  - 1. ```
      保持PCR管在磁力架上，加入200μl 新鲜配制的80%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠， 孵育30 sec后小心移除上清。
```
- 1. ```
    重复步骤5，总共漂洗两次。
```
  - 1. ```
      开盖干燥2.5 min左右。（磁珠刚好晾干，表面无光泽即可。不要让磁珠干裂）
```
- 1. ```
    磁珠晾干后，将PCR管从磁力架上取出，加入22 μl双蒸水覆盖磁珠，吹打混匀磁珠。
```
  - 1. ```
      室温孵育2min。（如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间。）
```
- 1. 将PCR管短暂离心收集置于磁力架中分离磁珠和液体。直到溶液澄清（约5 min）。
- 1. 小心吸取20μl 上清转移到新的EP管中，-20℃保存。
- 6. 长度分选 (可选步骤， 0.55×/1×的方案进行分选) (200~700bp)
  - 使用VAHTSTM DNA Clean Beads对扩增产物进行长度分选，使用前请将磁珠平衡至室温并涡旋振荡充分混匀。
  - ▲初始PCR产物体积为50 μl，因PCR过程中样品蒸发导致产物体积不足50 μl。进行分选操作前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至50 μl，否则分选片段的长度可能与预期不一致。
  - 1. 涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取27.5μl体积至50 μl PCR产物中，吹打10次充分混匀，室温孵育5 min。
  - （磁珠比较粘稠，请准确移取相应的体积，否则可能导致分选片段的长度与预期不一致。）
  - 1. 将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5 min)小心转移上清至新的灭菌PCR管中，丢弃磁珠。
  - 1. 涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取50μl体积至上清中，吹打10次充分混匀，室温孵育5 min。
  - 1. 将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5 min)小心移除上清。
  - 1. 保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠。室温孵育30 sec，小心移除上清。
  - 1. 重复步骤5，总计漂洗两次。
  - 1. 保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5 min。
  - 1. 将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。吹打10次充分混匀，室温孵育5 min。
  - 1. 将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5 min)小心吸取20μl上清至新PCR管中，-20°C保存。
  - (此外，如需获得长度分布更集中的文库，扩增产物可使用胶回收试剂盒进行片段长度分选和纯化。如对文库长度分布范围无特殊要求，扩增产物也可不进行长度分选直接使用磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化。
- 7. ATAC library QC:
  - A. Qubit定量:
    - 1. 按照如下体系配制溶液：
      - Qubit dsDNA HS assay各试剂加样量：
      - [图片上传失败...(image-bffcae-1561461961487)]
    - 1. 所有配制溶液进行涡旋震荡3 s，室温放置2 min。
    - 1. 按顺序插入Qubit进行检测，选择QubitdsDNA HS进行测量。
  - B. 荧光PCR定量（富集效果:GADPH/desert1>40 fold; B2M/deset2>20 fold）
    - 前期准备：
      - 按5倍进行梯度稀释的建库样品作为模板（或者基因组织DNA做定量标准曲线）
      - 荧光PCR相关试剂
      - 全自动医用PCR分析系统SLAN-96S
    - 使用引物信息如下:
      - 基因 | 正向引物 | 反向引物
      - GAPDH | CATCTCAGTCGTTCCCAAAGT | TTCCCAGGACTGGACTGT
      - Gene desert1 | AACTGGCTAGTAAGGAGTGAATG | GGAAAGTCCCTCTCTCTAACCT
      - B2M | GGGAATGGAAAGAAGTCCACTAT | GCGACGCCTCCACTTATATT
      - Gene desert2 | CCCAAACTCTGAGAGGCTTATT | GAGCCATCATCTAGACACCTTC

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